田樹(shù)興 丁艷譜 周崇富 劉紅光 李軍山2,

1.云南神威施普瑞藥業(yè)有限公司，云南 楚雄 675000；2.楚雄神威施普瑞藥物研究有限公司，云南 楚雄 675000；3.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430

姜味草為唇形科植物姜味草MicromeriabifloraBenth.的干燥全草，別名地生姜、小姜草、小香草，味苦，辛，性溫，具有溫中散寒、理氣止痛的功效[1-3]，分布于貴州、云南、西藏等地[4]，是云南常用草藥。已有報(bào)道通過(guò)水蒸氣蒸餾法和超臨界CO2提取姜味草中的揮發(fā)油，并采用CG-MS聯(lián)用法對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分析[5]；采用氣相色譜法對(duì)姜味草揮發(fā)油中橙花醛與香葉醛的含量進(jìn)行測(cè)定[6]；采用薄層色譜掃描法對(duì)云南不同產(chǎn)地姜味草中齊敦果酸的含量進(jìn)行測(cè)定[7]；采用高效液相色譜法對(duì)姜味草中非揮發(fā)性成分齊敦果酸和熊果酸的含量進(jìn)行測(cè)定[8]。齊墩果酸和熊果酸具有抗氧化、抗癌、降血脂、降血糖和保肝等功效[9-12]。通過(guò)實(shí)驗(yàn)建立高效液相色譜法測(cè)定姜味草中齊墩果酸和熊果酸含量的方法，為姜味草的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-2030 Plus高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；SK250LH超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；MS105DU 電子天平(d=0.00001 g)(瑞士梅特勒公司)。

1.2 藥品與試劑 姜味草購(gòu)自云南祿豐縣勤豐鎮(zhèn)恒康中藥經(jīng)營(yíng)部(產(chǎn)地為云南祿豐及云南華寧)、四川南部縣旭豐中藥材農(nóng)民專業(yè)合作社(產(chǎn)地為四川都江堰)，經(jīng)河北省藥品檢驗(yàn)研究院孫寶惠主任中藥師鑒定為唇形科姜味草屬植物姜味草MicromeriabifloraBenth.的干燥全草。齊敦果酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110709-20188，純度91.1 %)；熊果酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110742-201823，純度99.9 %)；甲醇(色譜純，德國(guó) Merck 公司)；乙醇(分析純)；冰醋酸(分析純)；三乙胺(分析純)；實(shí)驗(yàn)室用水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取齊敦果酸對(duì)照品10.80 mg和熊果酸對(duì)照品24.64 mg，置100 mL的量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品溶液(其濃度分別為 98.39 μg·mL-1和246.15 μg·mL-1)。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取姜味草粉末(過(guò)三號(hào)篩)約1.0 g，置150 mL的量瓶中，加入90 %乙醇25 mL超聲(功率250 W，頻率40 kHz)處理30 min，取出放至室溫，用90 %乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱為Thermo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(85∶15∶0.3∶0.5)；柱溫為 15 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；流速為 0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL。在色譜條件下齊敦果酸和熊果酸可達(dá)到基線分離，齊敦果酸和熊果酸的分離度大于1.5。如圖1所示。

1.齊敦果酸；2.熊果酸圖1 齊敦果酸和熊果酸對(duì)照品(A)和樣品(B)的HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液2、5、10、15、20、25 μL，分別注入液相色譜儀中，按上述“2.3”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積，以測(cè)定峰面積為為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得齊敦果酸回歸方程Y=62036.97X+2180.27，R=0.9997表明齊敦果酸進(jìn)樣量在0.20～2.46 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。得熊果酸回歸方程Y=146338.20X-1848.62，R=0.9999表明熊果酸進(jìn)樣量在0.49～6.15 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液 10 μL，分別注入液相色譜儀中，按上述“2.3”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果，齊敦果酸和熊果酸峰面積的RSD分別為0.17 %和0.09 %。表明本方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品(云南-祿豐)6份，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備并進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明齊敦果酸和熊果酸含量的RSD分別為1.57 %和1.63 %。表明本方法重復(fù)性好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.6”項(xiàng)下同批的樣品在0、4、8、12、16、20 h分別進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果20 h內(nèi)齊敦果酸和熊果酸峰面積無(wú)明顯變化，RSD分別為1.33 %和1.31 %，表明被測(cè)樣品在20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的樣品(云南-祿豐)，齊敦果酸和熊果酸的含量分別為：2.08 mg·g-1和5.58 mg·g-1適量，約1 g，共6分，精密稱定，分別加入0.488 mg/mL齊敦果酸和0.912 mg/mL熊果酸的混合對(duì)照品溶液1.5、2.5和5.0 mL，揮干溶劑，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品含量測(cè)定 分別取不同產(chǎn)地的姜味草，按供試品溶液制備方法制備，并進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 提取方式的選擇 本實(shí)驗(yàn)結(jié)合李坤平等[13]用體積分?jǐn)?shù)90%乙醇作為溶劑超聲提取，對(duì)提取溶劑、提取方法、提取時(shí)間三方面進(jìn)行優(yōu)化。①提取溶劑：對(duì)50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇和甲醇5種溶劑的提取效進(jìn)行比較，結(jié)果95%乙醇、無(wú)水乙醇和甲醇3種溶劑的提取率相近，50%乙醇和70%乙醇提取率較低；由于95%乙醇的毒性低且實(shí)驗(yàn)室較為常用，且無(wú)需提前對(duì)提取溶劑進(jìn)行配置。同時(shí)對(duì)齊敦果酸和熊果酸的測(cè)定無(wú)干擾，基線平穩(wěn)，故選用95%乙醇作提取溶劑;②提取方法：對(duì)加熱回流和超聲2種方法提取，提取率相近，考慮實(shí)驗(yàn)提取的快捷方便，故采用超聲提取作為提取方法;③提取時(shí)間：對(duì)供試品超聲時(shí)間20、30、45和60 min進(jìn)行考察，結(jié)果超聲20 min的提取率較低，30、45和60 min的提取率相近，故選擇30 min為提取時(shí)間。

3.2 檢測(cè)條件的選擇 齊敦果酸和熊果酸屬于五環(huán)三萜類化合物，極性相似，較難分離。選用甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(85∶15∶0.03∶0.06)，柱溫箱溫度25 ℃，流速1 mL·min-1時(shí)，齊敦果酸和熊果酸的保留時(shí)間較為接近，無(wú)法有效分離。繼而考察柱溫箱溫度15 ℃，流速0.8 mL·min-1；柱溫箱溫度15 ℃，流速0.5 mL·min-1時(shí)。結(jié)果兩種方法均能使齊敦果酸和熊果酸達(dá)到良好分離，分離度大于1.5。由于柱溫箱溫度15 ℃，流速 0.8 mL·min-1保留時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于柱溫箱溫度 15 ℃，流速0.5 mL·min-1。故選擇甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(85∶15∶0.03∶0.06)，柱溫箱溫度 15 ℃，流速0.8 mL·min-1為檢測(cè)條件。

由表2可知3個(gè)不同產(chǎn)地的姜味草中均含有齊敦果酸和熊果酸，但不同產(chǎn)地的姜味草中齊敦果酸和熊果酸含量的差別較大，其原因有待進(jìn)一步探討。

本研究建立了同時(shí)測(cè)定姜味草中齊敦果酸和熊果酸含量的方法，其結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且具有分離度好、靈敏度高、準(zhǔn)確性高、供試品制備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，為姜味草質(zhì)量評(píng)價(jià)及標(biāo)準(zhǔn)提升提供了良好的方法和依據(jù)。