劉 靚，雷佳蕾，梁佳蕊，鄧 紅，2，3，孟永宏，2，3，郭玉蓉，2，3

（1.陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062；2.國家蘋果加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，陜西西安710119；3.西部果品資源高值利用教育部工程研究中心，陜西西安710119）

0 引言

中國是蘋果栽培大國，種植面積與產(chǎn)量均居世界第一，2019僅陜西省蘋果產(chǎn)量達(dá)到1 135.58萬t，種植面積62萬hm2。除用作鮮食外，大量的外形欠佳、品質(zhì)良好蘋果被加工為果汁[1-2]。而全球每年消耗超過1 600萬t的果汁中蘋果汁占有重要的市場份額。近年來，隨著消費(fèi)者的健康意識不斷提高，NFC（Not form concentrate，非濃縮還原汁）蘋果汁的銷量日益增高。正是NFC果汁高昂的售價和廣闊的市場背景，使它成為摻假的目標(biāo)[3-4]。因此，NFC果汁的真實(shí)性一直是政府機(jī)構(gòu)與消費(fèi)者關(guān)注的問題；為了確保公平的市場競爭和消費(fèi)者利益并促進(jìn)國際貿(mào)易，急需開發(fā)能夠檢測NFC果汁真實(shí)性的技術(shù)，并在生產(chǎn)實(shí)踐與產(chǎn)品銷售中加以利用。

NFC（Not form concentrate，非濃縮汁）果汁產(chǎn)品摻假主要是用FC（Form concentrate，濃縮汁）加水復(fù)原代替NFC蘋果汁或是在NFC蘋果汁中摻入部分FC果汁進(jìn)行銷售，但FC與NFC果汁的化學(xué)成分差異不大，傳統(tǒng)的物理和化學(xué)分析方法難易區(qū)分FC與NFC，目前主要是利用穩(wěn)定同位素技術(shù)[5-6]進(jìn)行鑒偽；這種方法已經(jīng)獲得了美國分析化學(xué)師協(xié)會（AOAC）及歐盟標(biāo)準(zhǔn)化委員會（ComitéEuropéen de Normalisation，法文縮寫：CEN）的認(rèn)可（如標(biāo)準(zhǔn)ENV 12141和ENV 12142）。雷佳蕾等人[7]利用IRMS（Isotope ratio mass spectrometry，同位素比率質(zhì)譜法）分析測定了16個不同品種的蘋果NFC與FC果汁的δD、δ18O值，得出相似的結(jié)果；但I(xiàn)RMS[8-9]的定量分析還不盡人意。

陜西蘋果產(chǎn)量居中國第一，蘋果是帶動陜西經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱產(chǎn)業(yè)。蘋果中的多酚種類、含量與蘋果品種、原產(chǎn)地、種植條件、成熟期、生態(tài)環(huán)境等因素密切相關(guān)，中外學(xué)者對蘋果多酚的研究非常多且方法比較成熟[10-13]，尤其是不同品種的蘋果，所含有的蘋果多酚類物質(zhì)的種類及含量都不相同，不同品種蘋果間多酚的差異也是抗氧化能力不同的根本原因。

目前，對不同品種蘋果多酚的研究尚不多見，冉軍艦等人[14]在13種蘋果中均檢測出10種單體酚，鞣花酸、綠原酸、表兒茶素的含量相對較高，兒茶素、咖啡酸、原兒茶酸的含量相對較低。李鑫[15]以35個品種蘋果（Malus pumila Mill.）果實(shí)為材料，研究總酚、總原花青素等指標(biāo)，證實(shí)不同品種間總酚含量差異顯著。Urska Vrhovsek等人[16]研究了意大利、委內(nèi)瑞拉等西方國家的41個蘋果品種中的多酚物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)不同品種蘋果總多酚的平均含量在66.2～211.9 mg/100 g，主要類別是黃烷醇，其次是羥基肉桂酸、黃酮醇、二氫查耳酮和紅蘋果花青素。

探討不同品種蘋果汁NFC與FC中多酚種類含量差異的研究尚是空白，試驗(yàn)通過提取和分析研究不同品種蘋果的NFC與FC果汁中的多酚類物質(zhì)的種類和含量的差異，用于蘋果（NFC）果汁的真?zhèn)蔚蔫b別，試驗(yàn)結(jié)果為蘋果（NFC）果汁的質(zhì)量監(jiān)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

蘋果原料品種10個（自由、延光、橘蘋、富士、寒福、黛綠、嘎啦、首紅、喬納金、元帥）采于西北農(nóng)林科技大學(xué)白水蘋果試驗(yàn)站，并于4℃下冷藏保存；多酚標(biāo)準(zhǔn)品（沒食子酸，綠原酸，咖啡酸，4-羥基苯甲酸、兒茶素、表兒茶素、蘆丁、槲皮素、根皮素11種標(biāo)準(zhǔn)品），Sigma公司提供；試劑（無水乙醇、異丙醇、氯仿、瓊脂糖、乙酸乙酯、冰醋酸等均為分析純試劑，甲醇為色譜純試劑），西安市森博玻璃儀器采供站提供。

1260 Infinity型安捷倫高效液相色譜儀，上海安捷倫科技公司產(chǎn)品；C18型液相色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），上海安捷倫科技公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)分析方法

1.2.1 NFC、FC、AAJ蘋果汁的制備

NFC、FC蘋果汁的制備參照文獻(xiàn)[2]方法進(jìn)行，摻假果汁（Adulterated apple juice，AAJ）蘋果汁的制備參見文獻(xiàn)[9]。

1.2.2 不同品種NFC、FC蘋果汁中多酚的分析

（1）單體酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。參照文獻(xiàn)[11]分別稱取0.1 mg沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、4-羥基苯甲酸、兒茶素、表兒茶素、蘆丁、槲皮素、根皮素、根皮苷等標(biāo)準(zhǔn)品，分別溶于70%甲醇溶液中，定容至10 mL的棕色的容量瓶中混勻，放置于冰箱中，于4℃下避光保存?zhèn)溆茫V分析。根據(jù)單體酚標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間判斷混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖中各個峰所代表的多酚物質(zhì)。

（2）混合標(biāo)品標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。參照文獻(xiàn)[11，17]分別稱取沒食子酸0.1 mg、綠原酸0.6 mg、咖啡酸0.6 mg、4-羥基苯甲酸0.2 mg、兒茶素0.6 mg、表兒茶素0.6 mg、蘆丁0.8 mg、槲皮苷0.5 mg、根皮素0.5 mg、根皮苷0.5 mg、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品0.5 mg，溶于70%甲醇溶液中，定容至10 mL的棕色的容量瓶中混勻。分別從以上每個單體酚標(biāo)準(zhǔn)溶液中取出1 mL混合均勻，于4℃下避光保存?zhèn)溆?，待色譜分析；用于制作混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖。

（3）蘋果多酚的HPLC法測定色譜條件的確定。參照文獻(xiàn)[17]，選擇色譜柱為Welchrom C18，150 mm×4.6 mm，5 μm，紫外檢測波長為280 nm，進(jìn)樣量20 μL；流速1 mL/min，柱溫30℃；流動相A相0.3%的冰乙酸，流動相B相100%的甲醇（色譜純）。

（4）梯度洗脫程序參照文獻(xiàn)[18]確定。以100%的甲醇和0.3%的冰醋酸為流動相通過調(diào)整梯度洗脫程序及單體酚標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度以達(dá)到分離混合標(biāo)準(zhǔn)品中多酚物質(zhì)的目的，使混合標(biāo)準(zhǔn)品中的各個單體酚標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間相差較大，高效液相參照1.2.2（2）的方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照文獻(xiàn)[17-18]分別稱取沒食子酸0.1 mg、綠原酸6 mg、咖啡酸0.6 mg、對羥基苯甲酸0.2 mg、兒茶素0.6 mg、表兒茶素0.6 mg、蘆丁0.8 mg、槲皮素0.5 mg、根皮素0.5 mg、根皮苷0.5 mg、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品0.5 mg，分別溶于70%甲醇溶液中，定容至10 mL的棕色的容量瓶中，混和均勻[12]。分別從以上每種單體酚標(biāo)準(zhǔn)溶液中取出1 mL混合均勻，得到混合標(biāo)準(zhǔn)品。按照混合標(biāo)準(zhǔn)品與70%的甲醇體積為0.1∶1.9，0.2∶1.8，0.4∶1.6，0.8∶1.2，1.2∶0.8，1.6∶0.4，2.0∶0的方法取出混合標(biāo)準(zhǔn)品和甲醇混合均勻，制作7個不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品[15-17]。從7個不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品中每個取出1 mL通過0.45 μm的微孔濾膜過濾置于棕色樣品瓶中，于4℃下避光保存，待色譜分析。根據(jù)每種單體酚標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度及相對應(yīng)的峰面積得到其標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

式中：C1——1.2.2中所制得混合標(biāo)準(zhǔn)品中某標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——取出的混合標(biāo)準(zhǔn)品體積，mL；

M——稱取的對應(yīng)單體酚標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量，μg；

C2——NFC果汁中單體酚質(zhì)量濃度，μg/mL；

C——根據(jù)樣品多酚峰面積及相對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得樣品質(zhì)量濃度，μg/mL。

（4）蘋果NFC果汁中多酚物質(zhì)的提取溶劑的選擇。參照文獻(xiàn)[17-18]，分別用甲醇、乙酸乙酯、乙醇60 mL與蘋果清汁20 mL按照3∶1的比例混合后置于錐形瓶中，于溫度50℃，功率360 W的情況下超聲輔助提取40 min，用離心機(jī)以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心15 min，取上清液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃的條件下進(jìn)行旋蒸至干，用氮吹儀進(jìn)行氮吹后，用100%的甲醇進(jìn)行復(fù)溶，最后定容至5 mL的棕色容量瓶中。取出1 mL通過0.45 μm的微孔濾膜過濾，收集到棕色的樣品瓶中，待液相色譜進(jìn)樣分析。根據(jù)HPLC圖譜峰面積及所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中各種單體酚的質(zhì)量濃度，通過比較樣品中各種單體酚物質(zhì)的含量選擇最優(yōu)的提取溶劑為甲醇。

（6）方法學(xué)驗(yàn)證。精密度、穩(wěn)定性、加標(biāo)回收率參照文獻(xiàn)進(jìn)行，所有峰相對保留時間的RSD均在1%以內(nèi)，相對峰面積的RSD均在3%以內(nèi)，說明儀器精密度、穩(wěn)定性良好，該方法可行。各組分的加標(biāo)回收率計算如公式（3）。

式中：M1——實(shí)測值，將所測得單體酚的峰面積帶入對應(yīng)1.2.2方法所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到NFC果汁濃度，乘以體積20 mL得到樣品中多酚實(shí)際含量，mg；

M2——樣品中原本所含質(zhì)量，根據(jù)1.2.2方法所得樣品未加入標(biāo)準(zhǔn)品之前中原本所含有的各種單體酚的質(zhì)量，mg；

M3——添加量，向20 mL樣品中加入的單體酚質(zhì)量，mg；

Y——加標(biāo)回收率，%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有分析進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。使用Origin 8.0和SPSS 12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），p＜0.05被認(rèn)為是影響顯著。主成分分析（PCA，Principal Component Analysis）被用作評估每個數(shù)據(jù)集以檢測潛在異常值的探索性技術(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種蘋果汁多酚的分析結(jié)果

2.1.1 混和標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

按照1.2.2（3）方法進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)HPLC圖譜里出峰的情況不斷調(diào)整洗脫程序，得到分離度較好的混合標(biāo)準(zhǔn)品圖譜，確定最終的洗脫程序方法，通過HPLC檢測得到11種單體酚標(biāo)準(zhǔn)品混合物的HPLC圖。

對83例胃癌患者的性別，腫瘤的位置、直徑、Borrmann分型、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，以及新輔助化療和 CTC陽性等指標(biāo)，進(jìn)行COX單因素和多因素回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌患者術(shù)后生存的獨(dú)立影響因素為腫瘤分化程度、新輔助化療和 CTC陽性這3項(xiàng)指標(biāo)（P值分別為0.035、0.011和＜0.001，表2和表3）。

多酚洗脫程序見表1，11種多酚混合標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 11種多酚混合標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖

表1 多酚洗脫程序

根據(jù)11種單體酚標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間判斷混合標(biāo)準(zhǔn)品中各個色譜峰所對應(yīng)的單體酚種類，HPLC圖峰依次為沒食子酸-保留時間為8.859 min，4-羥基苯甲酸-保留時間為23.898 min，綠原酸-保留時間為29.326 min，咖啡酸-保留時間為33.998 min，兒茶素-保留時間為38.383 min，表兒茶素-保留時間為44.854 min，蘆丁-保留時間為68.660 min，槲皮素-保留時間為69.390 min，槲皮苷-保留時間為73.722 min，根皮苷-保留時間為78.896 min，根皮素-保留時間為80.743 min。

根據(jù)1.2.2（4）采用外標(biāo)法對分別對選取的11種多酚標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行線性回歸分析。準(zhǔn)確取混合標(biāo)準(zhǔn)品0.1，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL，用70%甲醇添至2 mL，通過0.45 μm的濾膜過濾，進(jìn)行高效液相色譜法檢測，最后利用質(zhì)量濃度和峰面積建立線性回歸方程。

單體酚標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程見表2。

表2 單體酚標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程

2.1.2 10個品種的蘋果NFC與FC果汁樣品中多酚的種類與質(zhì)量濃度

根據(jù)1.2.2（5）方法可以得到樣品色譜圖中所含有多酚的種類，再根據(jù)樣品中多酚的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線，對10個品種的蘋果NFC與FC果汁樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，得到所有樣品中多酚的質(zhì)量濃度與種類，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

10個品種的蘋果NFC果汁樣品中多酚的種類與質(zhì)量濃度見表3，10個品種的NFC蘋果汁（a）與FC蘋果汁（b）的高效液相色譜圖見圖3，10個品種的蘋果FC果汁樣品中多酚的種類與質(zhì)量濃度見表4。

由表3可知，10個品種的蘋果NFC果汁樣品都含有4-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、槲皮素這5種多酚物質(zhì)，且在質(zhì)量濃度上具有顯著性差異；其中綠原酸在10個品種的蘋果NFC果汁樣品中含量最多；試驗(yàn)所有樣品中不含有兩種多酚物質(zhì)即根皮苷、根皮素。

表3 10個品種的蘋果NFC果汁樣品中多酚的種類與質(zhì)量濃度/μg·mL-1

由表4可知，與相同品種NFC蘋果汁相比較，F(xiàn)C蘋果汁中的多酚種類和含量明顯減少，在寒富品種FC果汁中出現(xiàn)了根皮素，在喬納金、自由、延光、富士品種的FC的蘋果汁中出現(xiàn)了根皮素和根皮苷2種酚類。

表4 10個品種的蘋果FC果汁樣品中多酚的種類與質(zhì)量濃度/μg·mL-1

NFC蘋果汁的多酚種類和含量明顯多于FC蘋果汁，綠原酸在10個品種的蘋果NFC果汁樣品中都是含量最高，沒食子酸在10個品種NFC果汁樣品中出現(xiàn)（在紅富士蘋果NFC果汁中質(zhì)量濃度最高，在黛綠蘋果NFC果汁中含量最低），兒茶素僅在華碩、延光、首紅、元帥這4個品種NFC果汁樣品中出現(xiàn)（含量最高是元帥蘋果），蘆丁在富士、首紅、喬納金、元帥這4個品種NFC果汁樣品中出現(xiàn)（含量最高是元帥蘋果），槲皮苷僅在延光、富士、寒富、元帥這4個品種NFC果汁樣品中出現(xiàn)（含量最高是延光蘋果）；對羥基苯甲酸、咖啡酸、槲皮素分別在橘蘋、首紅、延光蘋果NFC果汁中含量最高。

FC蘋果汁中的多酚種類和含量明顯減少，但喬娜金蘋果FC蘋果汁中還含有10種多酚物質(zhì)，黛綠品種的FC果汁中綠原酸相比于NFC果汁來說并未損失，這一點(diǎn)直觀地體現(xiàn)在圖3（a）和圖3（b）中。毋庸置疑，不同品種蘋果的NFC中多酚種類與質(zhì)量濃度存在較大差異，而相同品種NFC和FC果汁中多酚的種類與含量也會產(chǎn)生很大變化，且FC果汁中由于濃縮工藝等加工方式等方面對多酚的影響，使得果汁中一些多酚物質(zhì)發(fā)生降解等反應(yīng)而出現(xiàn)新的多酚成分[11，13]。因此，如果NFC果汁中出現(xiàn)了根皮素和根皮苷兩種酚類，即可認(rèn)為是FC果汁摻假。當(dāng)然，還需要繼續(xù)增加蘋果加工品種為20～30種進(jìn)行NFC、FC蘋果汁中多酚成分分析，就可得到更有說服力的證據(jù)。

圖2 10個品種的NFC蘋果汁（a）與FC蘋果汁（b）的高效液相色譜圖

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

在精密度試驗(yàn)中選取綠原酸作為參照物質(zhì)將其保留時間定為1，選取表兒茶素作為參照物質(zhì)將其峰面積定為1，計算得出其他物質(zhì)的相對保留時間及相對峰面積，連續(xù)5次進(jìn)樣每次所得的HPLC圖譜數(shù)據(jù)（表5）知，多酚物質(zhì)相對保留時間RSD均小于1%，相對峰面積RSD均小于3%，說明高效液相色譜機(jī)的精密度良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)（表6）得到的結(jié)果，也是每種多酚物質(zhì)相對保留時間穩(wěn)定性的RSD均小于1%，相對峰面積RSD均小于3%。穩(wěn)定性相對保留時間RSD小于1%，說明高效液相色譜機(jī)穩(wěn)定性良好。加標(biāo)回收率試驗(yàn)，得到的結(jié)果也比較好，加標(biāo)回收率除綠原酸之外，均在90%以上，說明試驗(yàn)的提取方法和高效液相檢測方法良好。

試驗(yàn)方法精密度分析見表5。

表5 試驗(yàn)方法精密度分析

3 結(jié)論

（1）以甲醇為提取劑超聲輔助提取蘋果汁多酚，10個蘋果品種的NFC果汁都含有4-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、槲皮素5種多酚物質(zhì)（含量最高的是綠原酸），且在質(zhì)量濃度上具有顯著性差異；試驗(yàn)樣品中不含有根皮苷、根皮素2種多酚物質(zhì)。

（2）與相同品種NFC蘋果汁相比較，F(xiàn)C蘋果汁中的多酚種類和含量明顯減少。寒富品種的FC果汁中出現(xiàn)了根皮素，在喬納金、自由、延光、富士品種的FC蘋果汁中出現(xiàn)了根皮素和根皮苷2種酚類；該結(jié)果可作為辨別NFC果汁摻假的重要依據(jù)。該方法可能成為NFC果汁摻假檢驗(yàn)中追溯蘋果制品種源的有用工具。

試驗(yàn)方法穩(wěn)定性分析見表6。

表6 試驗(yàn)方法穩(wěn)定性分析