劉會 龐軍 譚洪文 田野 陳保林

(貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 貴陽 550002)

近年來，急性心肌梗死(acute myocardial infarction,MI)發(fā)病率明顯上升，成為全世界致死和致殘的首要疾病，嚴重威脅人類健康。心肌梗死過程中，心肌細胞壞死、凋亡，導致心肌細胞銳減，非梗死區(qū)心肌細胞擴大、間質(zhì)纖維化，心肌收縮力下降從而引起心功能不全。減少心肌細胞壞死、凋亡，抑制心肌纖維化意義重大。賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)具有穩(wěn)定細胞外基質(zhì)免受基質(zhì)金屬蛋白酶降解的功能[1]，LOX表達量與心肌纖維化的程度相關(guān)[2]。目前有研究[3]表明，LOX參與冠心病等疾病的發(fā)生及發(fā)展。Xiao Y等復制獼猴心肌梗死模型，提取梗死區(qū)心肌組織測定LOX RNA和蛋白，梗死區(qū)心肌組織LOX表達較假手術(shù)組明顯增加。目前的研究僅涉及LOX在急性心肌梗死模型中的表達情況，而藥物是否可逆轉(zhuǎn)急性心肌梗死心肌中LOX表達尚未見相關(guān)報道?；谏鲜?，本實驗旨在觀察阿托伐他汀對急性心肌梗死小鼠心肌組織LOX表達的影響。報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗材料 8周齡SPF級健康雄性C57BL/6小鼠45只 [合格證編號：SCXK(京)2006-000]置于室溫22℃～25℃、相對濕度為45%左右的動物房內(nèi)顆粒飼料(許可證號：SCXK-(粵)2008-0002)飼養(yǎng)，均自由飲水。隨機選取30只制作急性心肌梗死模型，2%異氟烷吸入麻醉，仰臥位固定在手術(shù)板上，沿左側(cè)胸大肌外側(cè)緣做1 cm皮膚切口，鈍性分離胸肌，將蚊式血管鉗插入左側(cè)第4或第5肋間，迅速撐開肋間擠出心臟，用6-0絲線于左冠狀動脈前降支處打結(jié)，根據(jù)左室前壁心肌顏色變化明確缺血是否成功，然后將心臟送回胸腔，縫合胸部皮膚切口之后將小鼠放回籠中(JONS法)[4]。心肌梗死模型小鼠分為2組，每組15只。MI組(予等量生理鹽水灌胃)；治療組(急性心肌梗死模型建立后予阿托伐他汀2 mg.kg-1.d-1灌胃)。另取15只健康雄性C57BL/6小鼠設(shè)為對照組。

1.2方法 (1)組織標本處理和左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)測定 4周末，2%異氟烷吸入麻醉小鼠，仰臥位固定在手術(shù)板上開胸取出完整的心臟，肝素鹽水洗凈心腔內(nèi)殘流血液，去除心外膜、右心室和左右心房，保留室間隔，用濾紙吸去多余的水份，OCT包埋后迅速凍于液氮中，冰凍切片機沿左室長軸將心肌組織切成7 μm的切片；部分心肌分成若干部分裝于EP管中，其后凍存于液氮中檢測RNA和蛋白質(zhì)。(2)TUNEL染色：7 μm的心肌組織冰凍切片用4%的多聚甲醛溶液固定10 min后，PBS漂洗3次，TritonX100穿膜5 min，PBS漂洗3次，加入混合好的TUNEL染液在37℃下反應60 min，PBS漂洗3次，封片后在熒光顯微鏡下觀察拍照，Image Pro軟件計數(shù)TUNEL陽性細胞數(shù)。每個切面取5個視野進行計數(shù)，取其平均值。(3)實時熒光定量PCR法測定：參照試劑盒說明書提取凍存左心室心肌組織總RNA，紫外分光光度測定其260 nm和280 nm的吸光度值(A)，計算總RNA的純度。A260/A280在1.9-2.1之間認為純度符合要求。依據(jù)公式(RNA樣品濃度=A260×40 μg/L×稀釋倍數(shù))計算RNA樣本濃度，配制出50 μg/L 的20 μL RNA樣本稀釋液，取5 μL進行逆轉(zhuǎn)錄。采用Icyclery IQ real-time PCR儀檢測LOX和MMP-2 mRNA表達水平。所有引物均參造Genebank提供的序列，由大連晨鈺生物有限公司合成。β肌動蛋白(β-actin)上游引物：5’-TTGTGCCTCTGTGTCGCATCCT-3’，下游引物：5’-GCTGACTAGCAGTCACTGCTA-3’，擴增片段為154bp；LOX上游引物:5’- ATGGTCGCTCGCAGATGATCG -3’，下游引物：5’- AGCTGTGAGATCTTCTCTGGC -3’，擴增片段為246bp；MMP-2上游引物:5’- ATGTCTGCTGATCGTTCATCG -3’，下游引物：5’- ACGTGCGAGACTGAGT GTAGC -3’，擴增片段為348bp。反應條件為：預變性95 ℃×10 min，變性95 ℃×10 sec，退火/延伸60 ℃×45 sec，循環(huán)38次。(4)Western Blot法檢測：參照試劑盒說明書提取小鼠左心室心肌組織全蛋白，測定蛋白濃度。取50 μg全蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，15%脫脂牛奶室溫下封閉60 min，將膜與特異性抗體在4 ℃結(jié)合過夜(β-actin：鼠抗單克隆抗體，1:2 000；LOX：羊抗人多克隆抗體，1:500；MMP-2：鼠抗單克隆抗體，1:500；)，次日PBST漂洗10 min×3次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二級抗體(β-actin：山羊抗小鼠，1:20 000；LOX：鼠抗羊，1:500； MMP-2：兔抗鼠，1:500；)室溫下?lián)u床上反應 60 min，PBST漂洗10 min×3次，加入ECL液，曝光、顯影、定影，用Bandscan軟件分析條帶像素灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠一般情況比較 對照組15只小鼠全部存活，小鼠活潑；MI組存活13只；治療組存活14只；MI組及治療組小鼠活動較對照組稍差。解剖死亡小鼠發(fā)現(xiàn)心臟破裂、腹水。

2.2各組小鼠心肌組織TUNEL染色 TUNEL染色顯示，對照組小鼠心肌細胞凋亡數(shù)為(6±3.0)/高倍鏡視野，MI組小鼠梗死周邊區(qū)細胞凋亡數(shù)為(18±7.0)/高倍鏡視野(P<0.05)，治療組小鼠梗死周邊區(qū)細胞凋亡數(shù)為(12±5.0)/高倍鏡視野，比MI組減少了33%(P<0.05)。見圖1，表1。

注：a.對照組；b.MI組；c.治療組。圖1

表1 各組小鼠左心室心肌組織TUNEL染色

2.3各組小鼠左心室心肌組織LOX和MMP-2 mRNA表達 與對照組比較，MI組小鼠心肌組織LOX和MMP-2 mRNA表達明顯增加(P<0.05)；與MI組比較，治療組小鼠心肌組織LOX和MMP-2 mRNA表達明顯下降(P<0.05)。見表2。

2.4各小鼠左心室心肌組織LOX、MMP-2蛋白表達 與對照組比較，MI組小鼠心肌組織LOX、MMP-2蛋白表達明顯增加(P<0.05)；與MI組比較，治療組小鼠心肌組織LOX、MMP-2蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.05)。見表2、圖2。

注：LOX：賴氨酰氧化酶；MMP-2：基質(zhì)金屬蛋白酶-2； 1：對照組；2：MI組；3：治療組。圖2 各組小鼠左心室心肌組織LOX、MMP-2蛋白表達

表3 各組小鼠左心室心肌組織LOX、MMP-2蛋白表達

2.5小鼠左心室心肌組織LOX與MMP-2指標的關(guān)系 MI組小鼠梗死周邊區(qū)域細胞凋亡數(shù)與左心室心肌組織LOX(r= 0.79，P= 0.03)、 MMP-2(r= 0.81，P= 0.02)表達均呈正相關(guān)。

3 討 論

隨著人口老年化的發(fā)展，心肌梗死發(fā)病率居高不下，心肌梗死后心肌細胞凋亡、心肌間質(zhì)纖維化，最終導致心肌收縮力下降、心肌功能障礙、室性心律失常和心源性猝死[5]，梗死區(qū)及非梗死區(qū)心肌組織節(jié)段及心肌厚度均發(fā)生異常變化，心肌細胞凋亡及壞死進一步加重心肌纖維化[6]，因此，抑制心肌細胞凋亡及心肌纖維化有助于改善心功能及遠期預后。目前研究表明，LOX參與冠心病等疾病的發(fā)生及發(fā)展。LOX在心肌重塑過程中發(fā)揮不可替代的作用。在瓣膜性心臟病心肌組織中，LOX表達增加促進血管緊張素-II介導的心肌組膠原纖維及彈性纖維增加，進一步促進心臟擴大及心功能不全[7]。制作主動脈瘺介導的容量負荷增加型心力衰竭小鼠模型，發(fā)現(xiàn)心肌組織LOX表達明顯增加，而且LOX表達增加促進心肌組織膠原纖維表達及心肌纖維化[8]。此外有研究表明，心肌梗死動物模型心肌組織LOX表達明顯上調(diào)，心肌梗死8周后，心肌組織膠原纖維明顯增加，基質(zhì)金屬蛋白酶-1表達明顯下調(diào)，金屬蛋白酶抑制因子-1表達無明顯變化[9]。復制獼猴心肌梗死模型，提取心肌組織RNA和蛋白，檢測發(fā)現(xiàn)梗死區(qū)心肌組織LOX表達較假手術(shù)組明顯增加，此外，心肌組織I型及III型膠原纖維也明顯增加[3]。以上研究均表明，LOX在急性心肌梗死心肌組織中表達增加。我們的實驗表明，MI組小鼠心肌組織LOX mRNA及蛋白表達顯著升高，TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，心肌細胞凋亡數(shù)也增加，與之前的研究結(jié)果一致。因此，對LOX的調(diào)節(jié)與干預在急性心肌梗死的治療過程中具有非常重要的意義。

他汀類藥物已經(jīng)廣泛應用于冠心病患者并取得明顯效果，可改善心肌梗死后心室重塑[10]，然而他汀類藥物的多效性是否可通過調(diào)節(jié)LOX表達而保護受損的心肌目前研究仍然較少?，F(xiàn)有研究表明，阿托伐他汀可通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達變化而顯著降低動脈粥樣硬化兔心肌膠原蛋白的表達，從而緩解心肌纖維化[11]。既往我們的研究表明，阿托伐他汀可下調(diào)糖尿病心肌病小鼠心肌組織LOX mRNA及蛋白表達，從而發(fā)揮心肌保護作用[12]。此外，在慢性心力衰竭小鼠心肌組織中，他汀可通過調(diào)節(jié) LOX-p38-MMP-9信號軸發(fā)揮心肌保護作用[13]。此外，有研究表明，結(jié)扎冠狀動脈前降支復制急性心肌梗死小鼠模型，發(fā)現(xiàn)心肌梗死周邊區(qū)域及梗死區(qū)域的心肌組織LOX RNA及蛋白質(zhì)表達明顯增加，梗死區(qū)域心肌組織纖維化明顯增加，轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路促進LOX表達增加從而促進促進心肌纖維化及心臟重塑，引起心臟擴大及心功能不全，加入LOX的特異性抑制劑β-氨基丙后心肌梗死區(qū)域的LOX表達下降，心肌纖維化減輕，心功能不全好轉(zhuǎn)[14]。此外，TGF-β信號通路還可上調(diào)LOX的表達促進擴張型心肌病心肌組織的III型膠原纖維表達[15]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，MI組小鼠梗死周邊區(qū)域細胞凋亡數(shù)增加，心肌組織LOX、MMP-2 mRNA和蛋白表達明顯上調(diào)；相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，MI組小鼠梗死周邊區(qū)域細胞凋亡數(shù)與左心室心肌組織LOX和MMP-2表達呈正相關(guān)。故我們推測，MI小鼠左心室心肌組織MMP-2表達與LOX表達變化有關(guān)。應用阿托伐他汀干預MI小鼠后，梗死周邊區(qū)域細胞凋亡數(shù)下降，心肌組織LOX、MMP-2 mRNA蛋白表達下降。阿托伐他汀可逆轉(zhuǎn)急性心肌梗死小鼠心肌組織LOX表達，LOX可調(diào)節(jié)MI小鼠心肌組織MMP-2表達。阿托伐他汀是否可通過別的信號通路調(diào)節(jié)MMP-2表達，本研究未涉及。

綜上所述，阿托伐他汀可下調(diào)急性心肌梗死小鼠心肌組織LOX表達。這可能是阿托伐他汀治療急性心肌梗死又一依據(jù)。