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        甲硝唑誘導斑馬魚骨丟失模型的建立*

        2022-01-17 07:07:48張麗媛納青青周麗敏
        醫(yī)藥導報 2022年1期
        關(guān)鍵詞:茜素斑馬魚甲硝唑

        張麗媛,納青青, 周麗敏

        (廣東醫(yī)科大學1.解剖學教研室;2.藥理學教研室, 湛江 524023 )

        糖尿病性骨質(zhì)疏松是糖尿病常見、多發(fā)的并發(fā)癥,給患者及社會帶來嚴重的影響[1]。建立理想的糖尿病性骨質(zhì)疏松動物模型是研究預防和治療糖尿病性骨質(zhì)疏松新藥的基礎。對糖尿病性骨質(zhì)疏松的實驗研究國內(nèi)外均有大量的文獻報道,大多數(shù)的體內(nèi)研究均涉及建立骨質(zhì)疏松動物模型的問題[2-4]。目前采用的模型主要分為兩大類:在體實驗和離體實驗。離體實驗主要是利用體外成骨或破骨原代細胞模型[5-7],其實驗條件苛刻,難于掌握和控制,并且作用環(huán)節(jié)相對單一,不能體現(xiàn)在體實驗的綜合效果。另一類在體實驗大多采用大鼠高脂高糖飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素進行構(gòu)建[8-9],其實驗強度大,靈敏度低,耗時長且不能對微量化合物實現(xiàn)藥效評價。所以,尋找一個能模擬糖尿病核心病理的快速、高效、可靠并且可以高通量篩選藥物的新型體內(nèi)模型顯得十分重要。

        隨著人們對斑馬魚骨骼研究不斷發(fā)展和完善,斑馬魚模型已逐漸成為一種新的易于檢測的體內(nèi)模型,為探討骨骼發(fā)育以及篩選保護骨骼類藥物如抗骨質(zhì)疏松有效活性成分快速篩選提供新的方法,對中藥資源的開發(fā)尤其是微量成分獨特抗骨質(zhì)疏松活性的研究具有重要意義[10-12]。斑馬魚具有的生理和生化特征使其在藥效評價方面克服了傳統(tǒng)哺乳動物靈敏度低、耗時長且微量化合物不能實現(xiàn)的缺點,在骨質(zhì)疏松癥研究中應用具有一定的可行性和必要性。

        PISHARATH等[13]實驗發(fā)現(xiàn)把甲硝唑加入轉(zhuǎn)基因斑馬魚的養(yǎng)殖水中,可以破壞轉(zhuǎn)基因斑馬魚的胰島β細胞,并且不會導致轉(zhuǎn)基因斑馬魚的畸形和大量死亡。貴陽中醫(yī)學院課題組也建立并篩選獲得胰島β細胞發(fā)育的轉(zhuǎn)基因斑馬魚,證實了此種方法可以獲得一種化學遺傳學破壞胰島β細胞的活體斑馬魚疾病模型[14]。本研究課題希望能通過甲硝唑破壞胰島β細胞構(gòu)建轉(zhuǎn)基因斑馬魚骨丟失模型,為篩選可保護胰島β細胞的促骨形成藥物提供合格方便的動物模型。

        1 材料與方法

        1.1材料 斑馬魚(廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院斑馬魚平臺提供);依替膦酸二鈉(中國食品藥品檢定研究院,批號:101174-201001);茜素紅(Sigma公司,批號:ZY1156);甲硝唑(康美藥業(yè)股份有限公司,批號:170207-2);斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(美國Aquaneering公司);TCS SP5II共聚焦激光掃描顯微鏡、倒置相差熒光顯微鏡、熒光顯微鏡(德國Leica公司)。

        1.2方法

        1.2.1斑馬魚胚胎收集和培養(yǎng) AB品系斑馬魚幼魚,全自動化控溫控光和水處理、循環(huán)的斑馬魚專用養(yǎng)殖系統(tǒng)進行日常維護,水溫度為28.5 ℃,pH值約7.0,12 h晝夜時間交替,全飼料喂養(yǎng)。

        1.2.2轉(zhuǎn)基因斑馬魚系的建立 清晨收集雌、雄斑馬魚交配獲得的處于1個細胞期的受精卵,固定于瓊脂糖平板上注射。將制備好的質(zhì)粒p-IsceI-INS:nfsB注射入所有胚胎后置于孵化液中,在28.5 ℃中進行孵化。養(yǎng)至3個月性成熟期與野生型一對一雜交,收集每對交配魚生產(chǎn)的所有受精卵,獲得穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系(F1代)。

        1.2.3構(gòu)建甲硝唑誘導轉(zhuǎn)基因斑馬魚胰島β細胞破壞模型 受精后30 h的F1代轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎放入24孔板中,先加入培養(yǎng)基1 mL,再加入不同濃度(5,10,15 mmo·L-1)甲硝唑溶液,作為甲硝唑組,28.5 ℃中共同避光孵育,nfsB蛋白將無毒性的甲硝唑轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎舅?,在轉(zhuǎn)基因斑馬魚體內(nèi)能直接靶向性破壞胰島β細胞。48 h后及時更換胚胎養(yǎng)殖水終止甲硝唑的破壞作用。同時設立濃度1%二甲亞砜為陰性對照組及不給予特殊處理的正常對照組。

        1.2.4甲硝唑誘導轉(zhuǎn)基因斑馬魚胰島β細胞破壞模型血糖和晚期糖基化終末產(chǎn)物的測定 按照“1.2.3”項方法造模后,常規(guī)飼養(yǎng)至28 d的斑馬魚胚胎置于MS-222中麻醉致死,去除MS-222溶液,用吸水紙擦拭魚身,去除所有水分,避免血糖測定時血液稀釋。用解剖鉗取出一只眼睛,直到眼腔充滿血液,用注射器抽取血液備用。測定所取血中的血糖含量,使用魚血紅蛋白晚期糖基化終末產(chǎn)物酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒測定晚期糖基化終末產(chǎn)物,方法按照說明書進行。

        1.2.5茜素紅染色法檢測造模法對斑馬魚幼魚頭骨骨形成的影響 按照“1.2.3”項方法造模后,常規(guī)飼養(yǎng)至10 d的斑馬魚胚胎置于MS-222中麻醉致死,加入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定,然后使用茜素紅對斑馬魚進行染色。

        1.2.6礦化骨骼的定量分析 用ZEISS熒光倒置顯微鏡觀察茜素紅染色的斑馬魚頭骨腹面,用Axio VisionRe1.4.6版成像軟件采集圖像(100倍),所有的圖像均采用相同的光強度和曝光設置。用Image pro plus 6.0版專業(yè)圖像分析軟件計算茜素紅染色區(qū)域面積以及累積吸光度(A),以分別反映骨礦化量和骨密度。每種處理的樣本量為5。

        1.2.7依替膦酸二鈉對破壞β細胞誘導的轉(zhuǎn)基因斑馬魚骨丟失的防治作用 按照“1.2.3”項方法,模型建立48 h后,加入依替膦酸二鈉溶液,每天換藥,培養(yǎng)至第10天。然后按照“1.2.5”項方法進行染色,采集圖像并計算染色面積和累積A值。

        2 結(jié)果

        2.1破壞β細胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚血糖和晚期糖基化終末產(chǎn)物的測定 結(jié)果見圖1,2,與正常對照組和陰性對照組比較,用甲硝唑處理的轉(zhuǎn)基因斑馬魚血糖含量升高,晚期糖基化終末產(chǎn)物表達水平顯著升高(P<0.05)。雖然3種濃度的甲硝唑處理轉(zhuǎn)基因斑馬魚都能升高血糖,隨著甲硝唑濃度的增高,轉(zhuǎn)基因斑馬魚的血糖濃度會更高,但是在高濃度(15 μmol·L-1)下,轉(zhuǎn)基因斑馬魚的畸形率和死亡率都較高,故10 μmol·L-1甲硝唑比較合適。

        A.正常對照組;B.陰性對照組;C.5 mmol·L-1甲硝唑組;D.10 mmol·L-1甲硝唑組;E.15 mmol·L-1甲硝唑組。①與正常對照組比較, F=72.211,P<0.05;②與陰性對照組比較, F=61.172,P<0.05。圖1 5組斑馬魚胚胎血液的血糖比較A.normal control group;B.negative control group;C.5 mmol·L-1 metronidazole group;D.10 mmol·L-1metronidazole group;E.15 mmol·L-1 metronidazole group.①Compared with the normal control group,F(xiàn)=72.211,P<0.05;② Compared with the negative control group,F(xiàn)=61.172,P<0.05.Fig.1 Comparison of blood glucose among five groups of zebrafish

        A.正常對照組;B.陰性對照組;C.5 mmol·L-1甲硝唑組;D.10 mmol·L-1甲硝唑組;E.15 mmol·L-1甲硝唑組。①與正常對照組比較, F=38.805,P<0.05;②與陰性對照組比較, F=44.665,P<0.05。圖2 5組斑馬魚胚胎血液的晚期糖基化終末產(chǎn)物比較A.normal control group;B.negative control group;C.5 mmol·L-1 metronidazole group;D.10 mmol·L-1 metronidazole group;E.15 mmol·L-1 metronidazole group.①Compared with the normal control group,F(xiàn)=38.805,P<0.05;②Compared with the negative control group,F(xiàn)=44.665,P<0.05.Fig.2 Comparison of advanced glycation end products in the blood of five groups of zebrafish

        2.2破壞β細胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼魚骨礦化情況 破壞β細胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚組與陰性對照組斑馬魚茜素紅染色顯微成像見圖3,與陰性對照組比較,可見10和15 μmol·L-1甲硝唑破壞β細胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的茜素紅染色面積和染色強度明顯減少。

        用專業(yè)圖像軟件計算的染色面積(骨礦化面積)和累計A值 見表1。與陰性對照組比較,低濃度(5 μmol·L-1)甲硝唑組轉(zhuǎn)基因斑馬魚骨礦化面積有所降低。隨著甲硝唑濃度不斷增加,骨礦化面積呈明顯降低趨勢,當甲硝唑濃度為10 μmol·L-1時,斑馬魚骨骼礦化量與陰性對照組比較呈顯著性降低;當甲硝唑濃度提高至15 μmol·L-1時,這種差異呈極顯著性。提示甲硝唑可誘導斑馬魚骨骼礦化量顯著降低,且呈濃度依賴性。甲硝唑?qū)值的影響與其對骨礦化面積的影響相似,隨著甲硝唑濃度的增加也呈現(xiàn)降低趨勢。與陰性對照組比較,低濃度甲硝唑組的A值顯著性降低,當濃度增加到10 μmol·L-1時,A值顯著性降低,當濃度提高至15 μmol·L-1時,A值的降低呈極顯著性。上述實驗結(jié)果顯示甲硝唑可誘導轉(zhuǎn)基因斑馬魚骨密度顯著降低。

        表1 5組轉(zhuǎn)基因斑馬魚頭骨礦化面積和累計A值比較Tab.1 Comparison of mineralized area and cumulative A value of skull among five groups of transgenic zebrafish

        A.正常對照組;B.陰性對照組;C.5 mmol·L-1甲硝唑組;D.10 mmol·L-1甲硝唑組;E.15 mmol·L-1甲硝唑組。圖3 茜素紅染色觀察甲硝唑?qū)D(zhuǎn)基因斑馬魚骨骼的影響(×100)A.normal control group;B.negative control group;C.5 mmol·L-1 metronidazole group;D.10 mmol·L-1 metronidazole group;E.15 mmol·L-1 metronidazole group.Fig.3 Effect of metronidazole on transgenic zebrafish’s skeleton observed by alizarin red staining(×100)

        2.3依替磷酸二鈉對甲硝唑破壞誘導的轉(zhuǎn)基因斑馬魚骨質(zhì)疏松的防治作用 正常對照組、10 mmol·L-1甲硝唑組和依替磷酸二鈉組斑馬魚骨的茜素紅染色顯微成像見圖4。用圖像分析軟件計算礦化面積和A值,結(jié)果見圖5。 與正常對照組比較,10 μmol·L-1甲硝唑能夠成功誘導轉(zhuǎn)基因斑馬魚的骨丟失。加用依替磷酸二鈉后,礦化面積和A值顯著增加(P<0.01),提示依替磷酸二鈉可防治甲硝唑誘導轉(zhuǎn)基因斑馬魚骨量的丟失。

        3 討論

        糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的病理與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥不同,目前在臨床上沒有針對糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的具體治療指南[15-16]。因此對糖尿病性骨質(zhì)疏松癥預防和治療的研究以及對防治糖尿病性骨質(zhì)疏松癥藥物高效、快速篩選已經(jīng)日益受到重視。但現(xiàn)有的評價糖尿病性骨質(zhì)疏松癥模型制約著抗骨質(zhì)疏松生物活性成分的快速高效高通量篩選,如小鼠、大鼠等動物模型實驗強度大,靈敏度低,耗時長,且不能對微量化合物實現(xiàn)藥效評價,而無脊椎動物如果蠅、蠕蟲等缺少人類疾病涉及的相關(guān)器官和組織,也限制了無脊椎動物模型在人類疾病研究中的應用。

        隨著人類對斑馬魚骨骼研究不斷發(fā)展和完善,斑馬魚模型已經(jīng)逐漸成為一種新的易于檢測的體內(nèi)模型,可為探討骨骼發(fā)育以及篩選保護骨骼類藥物如抗骨質(zhì)疏松有效活性成分快速篩選提供新的方法[17-18]。斑馬魚具有的生理和生化特征使其在藥效評價方面克服了傳統(tǒng)哺乳動物靈敏度低、耗時長且微量化合物不能實現(xiàn)的缺點,在骨質(zhì)疏松癥研究中應用具有一定的可行性和必要性。

        糖尿病病理核心是體內(nèi)胰島β細胞數(shù)量的絕對(1型)或相對(2型)減少,高血糖也是目前公認的導致糖尿病患者發(fā)生骨質(zhì)疏松的一個重要的高危因素,因此篩選具有保護和再生胰島β細胞作用的抗骨質(zhì)疏松藥物是治療糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的一個重要方向。本研究通過甲硝唑產(chǎn)生的細胞毒成分可以直接作用于轉(zhuǎn)基因斑馬魚胰島β細胞的DNA代謝過程,抑制細胞的脫氧核糖核酸的合成,影響細胞的生長、繁殖過程,最后導致胰島β細胞的死亡。本研究通過顯微注射重組質(zhì)粒p-IsceI-INS:nfsB構(gòu)建轉(zhuǎn)基因斑馬魚,通過甲硝唑破壞轉(zhuǎn)基因斑馬魚的胰腺β細胞,導致斑馬魚的血糖和晚期糖基化終末產(chǎn)物升高,并通過茜素紅染色發(fā)現(xiàn)甲硝唑處理后的轉(zhuǎn)基因斑馬魚頭骨骨骼的茜素紅染色區(qū)域以及累計A值較正常對照組都顯著下降(P<0.05),證明甲硝唑處理轉(zhuǎn)基因斑馬魚能導致高血糖狀態(tài),并且導致骨丟失情況的出現(xiàn)。

        本實驗建立的斑馬魚模型有以下的優(yōu)點:①減少了用于研究的哺乳動物的數(shù)量;②設置簡單,實現(xiàn)迅速,節(jié)省篩查藥物的時間;③經(jīng)濟,減少實驗的費用。因此,新模型允許研究胰島β細胞損傷后斑馬魚骨骼的變化情況,符合糖尿病的發(fā)病病因,為篩選可保護β細胞的具有抗骨質(zhì)疏松作用的有效化合物提供一個實用的篩選平臺。

        A.正常對照組;B.10 mmol·L-1甲硝唑組;C.依替磷酸二鈉組。圖4 依替磷酸二鈉對甲硝唑誘導轉(zhuǎn)基因斑馬魚骨丟失的影響(×160)A.normal control group;B.10 mmol·L-1 metronidazole group;C.etidroate disodium group.Fig.4 Effect of etidroate disodium on metronidazole-induced bone loss in transgenic zebrafish (×160)

        A.正常對照組;B.10 mmol·L-1甲硝唑組;C.依替磷酸二鈉組。①與正常對照組和依替磷酸二鈉組比較, F=31.457,P<0.01;②與正常對照組和依替磷酸二鈉組比較, F=44.092,P<0.01。圖5 3組轉(zhuǎn)基因斑馬魚骨礦化面積和累計A值比較A.normal control group;B.10 mmol·L-1 metronidazole group;C.etidroate disodium group.①Compared with the normal control group and etidroate disodium group,F(xiàn)=31.457,P<0.01;②Compared with the normal control group and etidroate disodium group,F(xiàn)=44.092,P<0.01.Fig.5 Comparison of bone mineralization area and cumulative A value among three groups of transgenic

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