季鵬 張進(jìn)香 王祥龍 葛健文 黃海琴

摘 要 目的 制備芹菜素絲素蛋白（API@SF）納米粒，并評價其安全性和抗腫瘤活性。方法 采用納米沉淀法制備API@SF納米粒，并對其形態(tài)、粒徑、Zeta電位、載藥量、體外釋放等進(jìn)行表征;采用溶血實驗和HE染色法評價該納米粒的安全性;采用MTT法評價該納米粒對小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果 本研究所制得的API@SF納米粒呈類球形，粒徑分布均勻，平均粒徑為406.61 nm，多分散性指數(shù)為0.154，Zeta電位為-18.4 mV，平均載藥量為5.20%。體外釋放結(jié)果顯示，該納米粒在pH 5.0的釋放介質(zhì)中釋放速率相對較快，在pH 7.4的釋放介質(zhì)中釋放速率相對較慢。溶血實驗和HE染色結(jié)果顯示，該納米粒具有良好的生物相容性。MTT實驗結(jié)果顯示，API@SF納米粒對4T1細(xì)胞的抑制作用顯著高于API原料藥（P<0.05），其作用機(jī)制可能與提高細(xì)胞中活性氧水平有關(guān)。結(jié)論 本研究成功制備了API@SF納米粒，該納米粒具有良好的安全性和抗腫瘤活性。

關(guān)鍵詞 芹菜素;絲素蛋白;納米粒;制備;安全性;抗腫瘤活性

中圖分類號 R944 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）01-0058-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.01.10

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To prepare apigenin silk fibroin （API@SF） nanoparticles and to evaluate their safety and anti-tumor activity. METHODS API@SF nanoparticles were prepared by nanoprecipitation method， and their morphology， particle size， Zeta potential， drug loading amount and in vitro release were characterized. The safety of nanoparticles was evaluated by hemolysis test and HE staining. MTT assay was adopted to evaluate inhibitory effects of API@SF nanoparticles on breast cancer 4T1 cells in mice. RESULTS The prepared API@SF nanoparticles were spherical with uniform distribution. The average particle size was 406.61 nm， the polydispersity index was 0.154， the Zeta potential was -18.4 mV， and the average drug-loading amount was 5.20%. The in vitro release results showed that the release rate of the nanoparticles was relatively fast in the release medium of pH 5.0 and relatively slow in the release medium of pH 7.4. Results of hemolysis test and HE staining showed that the nanoparticles had good biocompatibility. Results of MTT assay showed that the inhibitory effect of API@SF nanoparticles on 4T1 cells was significantly higher than that of API raw materials （P<0.05）， and its mechanism may be related to increasing the level of reactive oxygen species in cells. CONCLUSIONS API@SF nanoparticles are prepared successfully， which possess good safety and anti-tumor activity.

KEYWORDS? ?apigenin; silk fibroin; nanoparticles; preparation; safety; anti-tumor activity

癌癥作為一種長期困擾人類的惡疾，其致死率僅次于心血管類疾病;且由于腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)大的代謝補(bǔ)償和侵襲轉(zhuǎn)移能力，導(dǎo)致在其治療過程中會頻繁復(fù)發(fā)并累及多個器官，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量[1]。目前，臨床治療癌癥以手術(shù)切除、化療和放療為主，其中作為非侵入性治療的化療方式已被廣泛應(yīng)用，可有效地抑制癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[2]。雖然現(xiàn)有化療藥物效果較強(qiáng)，但生物相容性較差，在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時也會給正常器官帶來損傷[3]。因此，開發(fā)更多低毒高效的化療藥物迫在眉睫。

芹菜素（apigenin，API）別名芹黃素，是一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗腫瘤等多種藥理活性[4-5]。API已被證明對多種腫瘤細(xì)胞均具有顯著的抑制作用，其作用機(jī)制可能與抑制腫瘤細(xì)胞遷移或侵襲、促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及干擾腫瘤細(xì)胞信號通路有關(guān)[6]。由于API的水溶性較差，對腫瘤細(xì)胞缺乏選擇性，且其半衰期短、生物利用度相對較低，極大地限制了其進(jìn)一步臨床應(yīng)用[7]。因此，有必要改善API的溶解性和生物利用度，以獲得更好的抗腫瘤效果。

絲素蛋白（silk fibroin，SF）作為一種天然高分子生物材料，具有良好的生物相容性、降解性和可再生性;當(dāng)其作為藥物載體時，可增強(qiáng)藥物的控釋性、減少藥物的副作用和用藥次數(shù)[8]。基于此，本研究制備芹菜素絲素蛋白（API@SF）納米粒，并評價其安全性和抗腫瘤活性，以期為該納米粒的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有UV-1200型紫外可見分光光度計[尤尼柯（上海）儀器有限公司]、FA2004型萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）、pHS-3C型pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、KQ-500DB型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）、1510-02820C型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、JEM-F200型透射電子顯微鏡（日本Jeol公司）、CKX53型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）、Mastersizer-2000型粒度分析儀（英國Malvern公司）。

1.2 主要藥品與試劑

溴化鋰（LiBr）、API對照品、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（批號分別為C12143081、A800499、20191228，純度均大于98.0%）均購自上海麥克林生化科技有限公司;API原料藥（批號Le031663875，純度99.22%）購自上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司;磷酸二氫鉀（KH2PO4，批號20200818）購自中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司;無水磷酸氫二鈉（Na2HPO4，批號20181207）購自上海滬試化工有限公司;無水碳酸鈉（Na2CO3，批號20210401）購自無錫市亞盛化工有限公司;桑蠶絲素（批號180301）購自湖州新天絲生物科技有限公司;MTT試劑（批號20201105）購自美國Sigma公司;2，7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA，批號20210505）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;其余試劑為實驗室常用規(guī)格，水為去離子水。

1.3 動物

本研究所用動物為BALB/c小鼠，雌性，體質(zhì)量18～24 g，購自上海市計劃生育科學(xué)研究所，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2018-0006。小鼠飼養(yǎng)于溫度22～25 ℃、相對濕度50%的環(huán)境中，期間自由飲食。

1.4 細(xì)胞

本研究所用小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 SF的制備

參考文獻(xiàn)[9]方法，將0.02 mol/L Na2CO3溶液加熱煮沸后，加入桑蠶絲素1 g，繼續(xù)煮沸30 min，以60 ℃水洗滌3次，然后置于60 ℃烘箱中烘干過夜，即得絲素纖維;將絲素纖維溶于9.3 mol/L LiBr溶液中，置于60 ℃烘箱中烘干2 h;將上述溶液轉(zhuǎn)移至截留分子量為14 000 Da的透析袋中透析12 h，每隔4 h更換1次水，即得SF溶液;將SF溶液置于60 ℃烘箱中烘干過夜，即得SF。

2.2 API@SF納米粒的制備

采用納米沉淀法進(jìn)行制備。稱取SF適量，以水制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的SF溶液;將一定量API加入2 mol/L pH 8.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）中溶解，再加入5倍體積的SF溶液，混合均勻，于4 ℃條件下靜置4 h后，置于40 ℃水浴條件下磁力攪拌12 h;以12 000 r/min離心3 min，棄上清液，即得API@SF納米粒。

2.3 API的含量測定

采用紫外可見分光光度法測定API的含量[7]。

2.3.1 溶液制備 精確稱取API對照品適量，置于10 mL量瓶中，加入30%乙醇-DMSO混合溶液（9 ∶ 1，V/V，下同），超聲（頻率40 kHz，功率200 W，下同）溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為250 μg/mL的API貯備液。另取“2.2”項下的API@SF納米粒適量，置于10 mL量瓶中，加入30%乙醇-DMSO混合溶液2 mL，超聲溶解并定容，以0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液（API質(zhì)量濃度為250 μg/mL）。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取“2.3.1”項下API貯備液適量，以30%乙醇-DMSO混合溶液逐級稀釋，即得API質(zhì)量濃度分別為50、40、30、20、10、5 μg/mL的系列溶液;以30%乙醇-DMSO混合溶液為空白，采用紫外可見分光光度計于342 nm波長處測定吸光度。以吸光度（y）為縱坐標(biāo)、API質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程y=0.021 8x+0.009 0（R2=0.999 2），表明API的檢測質(zhì)量濃度在5～50 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 方法學(xué)考察 （1）精密度試驗：取“2.3.1”項下API貯備液適量，以30%乙醇-DMSO混合溶液制成API低、中、高質(zhì)量濃度（10、20、30 μg/mL）溶液，采用紫外可見分光光度計于342 nm波長處測定吸光度，以考察日內(nèi)精密度。結(jié)果顯示，API低、中、高質(zhì)量濃度溶液吸光度的日內(nèi)RSD分別為1.41%、0.70%、0.55%（n=6），均小于2%，表明該方法精密度良好。（2）穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液適量，于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后，采用紫外可見分光光度計于342 nm波長處測定吸光度，以考察穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，吸光度的RSD為1.17%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。（3）重復(fù)性試驗：取“2.2”項下API@SF納米粒，按“2.3.1”項下供試品溶液制備方法平行制備6份樣品溶液，采用紫外可見分光光度計于342 nm波長處測定吸光度，以考察重復(fù)性。結(jié)果顯示，吸光度的RSD為0.73%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。（4）加樣回收率試驗。取“2.3.1”項下供試品溶液100 μL，共6份，分別置于10 mL量瓶中，均加入“2.3.1”項下API貯備液100 μL，以30%乙醇-DMSO混合溶液定容，制成供試品溶液，采用紫外可見分光光度計于342 nm波長處測定吸光度并計算加樣回收率。結(jié)果顯示，平均加樣回收率為98.78%（RSD=1.39%，n=6），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.4 API@SF納米粒的表征

2.4.1 形態(tài)、粒徑及電位的考察 分別取API貯備液、SF溶液和API@SF納米粒適量，置于西林瓶中，觀察其外觀顏色。取API@SF納米粒適量，以水稀釋后，采用粒度分析儀測定其粒徑、Zeta電位及多分散性指數(shù)（polydispersity index，PDI）。另外，將上述稀釋后的API@SF納米?；鞈乙旱卧阢~網(wǎng)上，以1%磷鎢酸溶液染色60 s，用濾紙吸除多余染色液，于室溫條件下自然干燥后，采用透射電鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，本研究所制備的API@SF納米粒為淡黃色混懸液，呈單分散狀態(tài)，且無明顯沉淀;其粒徑分布均勻，呈正態(tài)分布，平均粒徑約為406.61 nm，PDI為0.154，Zeta電位為-18.4 mV;透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，該納米粒呈類球形。結(jié)果見圖1、圖2、圖3。

2.4.2 API@SF納米粒載藥量的測定 精確稱取API@SF納米粒2.1 mg，共3份，加入30%乙醇-DMSO混合溶液5.2 mL，超聲使其充分溶解后，以0.45 μm微孔濾膜濾過;取續(xù)濾液，采用紫外可見分光光度計于342 nm波長處測定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算API的含量，并計算API@SF納米粒的載藥量[載藥量（%）=We/Wm×100%，式中We表示包封于該納米粒中的藥量，Wm表示該納米粒的總質(zhì)量）。結(jié)果顯示，3份API@SF納米粒的載藥量分別為5.24%、5.19%、5.18%，平均載藥量為5.20%（RSD=0.68%，n=3）。

2.5 API@SF納米粒的體外釋放考察

參考文獻(xiàn)[7，10]方法，以含20%乙醇的PBS （pH分別為5.0、7.4）為釋放介質(zhì)，將API@SF納米粒置于截留分子量為14 000 Da的透析袋中，然后浸入上述不同釋放介質(zhì)（180 mL）中，并于37 ℃條件下以100 r/min的攪拌速率進(jìn)行釋放實驗。在預(yù)定的時間點(diǎn)（0、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48 h）取樣4 mL（同時補(bǔ)充4 mL釋放介質(zhì)），以0.45 μm微孔濾膜濾過;將濾液以30%乙醇-DMSO混合溶液適當(dāng)稀釋后，采用紫外可見分光光度計于342 nm波長處測定吸光度，計算API的累積釋放率，并繪制該納米粒的體外釋藥曲線，結(jié)果見圖4。由圖4可知，在pH 5.0的釋放介質(zhì)中，該納米粒釋放API的速率相對較快，在48 h時的累積釋放率約為90%;而在pH 7.4的釋放介質(zhì)中，該納米粒釋放API的速率相對較慢，在48 h時的累積釋放率約為60%。

2.6 API@SF納米粒的安全性評價

2.6.1 溶血實驗 參考文獻(xiàn)[11]方法，將BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，摘眼球取血;將血樣置于盛有玻璃珠的錐形瓶中，振搖10 min，以除去纖維蛋白原獲得血細(xì)胞。將所得血細(xì)胞以氯化鈉注射液清洗，然后以3 500? r/min離心10 min，棄去上清液，重復(fù)清洗、離心操作，直至上清液不顯紅色為止，即得紅細(xì)胞。將所得紅細(xì)胞加入氯化鈉注射液制成2%的混懸液，置于4 ℃冰箱中冷藏備用。取上述紅細(xì)胞混懸液分為陰性對照組（氯化鈉注射液）、陽性對照組（純化水）和不同濃度API@SF納米粒組（以API計，質(zhì)量濃度分別為0.05、0.075、0.1、0.15、0.2、0.4、0.6 mg/mL），每組設(shè)3個平行樣品。各組樣品分別加入相應(yīng)藥物2 mL，于37 ℃孵育30 min后，以3 500 r/min離心10 min;取上清液，采用紫外可見分光光度計于540 nm波長處測定其吸光度，并計算溶血率[溶血率（%）=（各給藥組吸光度-陰性對照組吸光度）/（陽性對照組吸光度-陰性對照組吸光度）×100%][12]。結(jié)果顯示，API@SF納米粒在API質(zhì)量濃度0.05～0.6 mg/mL范圍內(nèi)，其溶血率均低于5%，表明API@SF納米粒與血液的相容性較好，詳見圖5。

2.6.2 心肌毒性實驗 由于化療藥物普遍存在心肌毒性[13]，因此，本研究也考察API@SF納米粒的心臟毒性。取BALB/c小鼠3只，尾靜脈注射API@SF納米粒（以API計，20 mg/kg，劑量根據(jù)文獻(xiàn)[14-15]設(shè)置），每2天給藥1次，連續(xù)10 d。第11天時，處死小鼠，摘除心臟，剝?nèi)⌒募〗M織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)70%、80%、90%、95%乙醇和無水乙醇梯度脫水，再以二甲苯透明替換、浸蠟、包埋、切片（厚度約5 μm），經(jīng)HE染色后置于顯微鏡下觀察小鼠心肌組織的病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，在小鼠心肌組織中未觀察到炎癥損傷，表明API@SF納米粒沒有心肌毒性，詳見圖6。

2.7 API@SF納米粒抗腫瘤活性考察

2.7.1 API@SF納米粒對4T1細(xì)胞的抑制作用 采用MTT法進(jìn)行考察。將4T1細(xì)胞以含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基（以下簡稱“培養(yǎng)基”）于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時進(jìn)行實驗。取上述細(xì)胞，調(diào)整密度為5 000 mL-1，接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、API原料藥不同質(zhì)量濃度組（5、10、20、30、40、50 μg/mL，以API計，質(zhì)量濃度根據(jù)前期預(yù)實驗設(shè)置）和API@SF納米粒不同質(zhì)量濃度組（5、10、20、30、40、50? ? ?μg/mL，以API計，質(zhì)量濃度根據(jù)前期預(yù)實驗設(shè)置），每組設(shè)3個復(fù)孔?？瞻讓φ战M加入培養(yǎng)基100 μL，其余各組加入相應(yīng)含藥培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，繼續(xù)孵育4 h;棄去MTT溶液，以PBS洗滌2次，加入DMSO 100 μL，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。采用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定各孔的光密度（optical density，OD）值，并計算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率（%）=OD給藥組/OD空白對照組×100%]。采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果顯示，與空白對照組比較，API原料藥不同質(zhì)量濃度組和API@SF納米粒不同質(zhì)量濃度組細(xì)胞存活率均顯著降低（P<0.05），且呈明顯的濃度依賴趨勢;與同質(zhì)量濃度的API原料藥組比較，API@SF納米粒組細(xì)胞存活率均顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見表1。

2.7.2 API@SF納米粒對4T1細(xì)胞中活性氧水平的影響 參考文獻(xiàn)[16]方法進(jìn)行考察。將4T1細(xì)胞調(diào)整密度為2 × 104 mL-1，接種于24孔板中，每孔0.5 mL，培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、API原料藥組（25? ? ? ?μg/mL，以API計，質(zhì)量濃度根據(jù)前期預(yù)實驗設(shè)置）、API@SF納米粒組（25 μg/mL，以API計，質(zhì)量濃度根據(jù)前期預(yù)實驗設(shè)置），每組設(shè)3個復(fù)孔?？瞻讓φ战M加入培養(yǎng)基0.5 mL，其余各組加入相應(yīng)含藥培養(yǎng)基0.5 mL，培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，以PBS洗滌2次，加入10 μmol/L DCFH-DA溶液250 μL，繼續(xù)培養(yǎng)30 min;吸棄染色工作液，以PBS洗滌3次，采用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察并拍攝熒光圖像，使用Image J 1.48v軟件分析熒光強(qiáng)度，來表示活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。結(jié)果顯示，與空白對照組（熒光強(qiáng)度為0）比較，API原料藥組（熒光強(qiáng)度為3.45±1.33）、API@SF納米粒組（熒光強(qiáng)度為5.58±2.00）細(xì)胞中ROS水平均顯著升高（P<0.05）;與API原料藥組比較，API@SF納米粒組細(xì)胞中ROS水平顯著升高（P<0.05）。結(jié)果見圖7。

3 討論

API是一種天然黃酮類化合物，具有抗癌潛力，但因其水溶性差、細(xì)胞攝取率低、生物利用度低，從而限制了其在臨床上的應(yīng)用[7]。基于生物材料載體開發(fā)納米遞藥系統(tǒng)是藥劑學(xué)研究熱點(diǎn)之一，將藥物封裝在納米載體中可增強(qiáng)滲透和保留效應(yīng)，增加腫瘤組織內(nèi)的藥物積累，提高藥物的生物利用度和治療效果[17]。源自家蠶的SF是一種天然高分子生物材料，具有獨(dú)特的生物特性，如兩親性、無毒性、生物相容性和降解性，因此其在藥物載體相關(guān)研究中具有巨大潛力[18]。目前已經(jīng)有部分天然化合物（如紫杉醇、姜黃素、柚皮素、五羥黃酮、白藜蘆醇）被包載于SF納米載體中，且與這些游離藥物相比，被SF納米粒包載后的藥物具有更強(qiáng)的抗氧化和抗腫瘤活性[17]。

本研究基于SF載體，構(gòu)建了API@SF納米粒，該納米粒粒徑分布均勻，呈正態(tài)分布，平均粒徑為406.61 mm，平均載藥量為5.20%，Zeta電位為-18.4 mV。其中，Zeta電位是膠體分散穩(wěn)定性的關(guān)鍵決定因素，表示相鄰類似帶電粒子之間的靜電排斥程度，當(dāng)其絕對值大于15時，表明該粒子的穩(wěn)定性良好[19-20]。由此可知，本研究所制得的API@SF納米粒穩(wěn)定性良好。進(jìn)一步經(jīng)體外釋放考察發(fā)現(xiàn)，API@SF納米粒的釋放具有pH依賴性，且在酸性環(huán)境中可迅速釋放藥物，這提示該納米粒在酸性腫瘤微環(huán)境中可快速釋藥，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤活性。

經(jīng)安全性評價發(fā)現(xiàn)，本研究所制得的API@SF納米粒與血液具有較好的相容性，且無心肌毒性，提示該納米粒具有良好的安全性和臨床應(yīng)用價值?；诖?，筆者探討了其對小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的抑制作用，結(jié)果顯示，將API包載于SF中可增強(qiáng)API對4T1細(xì)胞的體外抑制作用，提示API@SF納米粒具有良好的抗腫瘤作用。ROS是一種含有氧自由基的高活性化學(xué)物質(zhì)，已被證明與癌癥的發(fā)展、轉(zhuǎn)移、進(jìn)展有關(guān)[21]。高濃度的ROS具有細(xì)胞毒性，可損傷細(xì)胞中的DNA、蛋白質(zhì)等，從而促使腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長[22]。本研究結(jié)果顯示，相比于API原料藥，API@SF納米?？稍?T1細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生更高水平的ROS，從而增強(qiáng)API的抗腫瘤活性。

綜上所述，本研究成功制備了API@SF納米粒，該納米粒具有良好的安全性和抗腫瘤活性。后續(xù)筆者將從動物水平深入探討該納米粒的藥動學(xué)和藥效學(xué)。

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