春花 魏丹丹 朱星昊 吳宗耀 達娃扎巴

摘 要 目的 研究藏藥珊瑚七十味丸對高脂血癥（HLP）模型大鼠的降脂作用，并初步探討其作用機制。方法 將60只SD大鼠按體質量隨機分為正常組、模型組、辛伐他汀組（陽性對照，20 mg/kg）和珊瑚七十味丸低、中、高劑量組（50、100、200 mg/kg），每組10只。正常組大鼠飼喂常規(guī)飼料，其余各組大鼠飼喂高脂飼料建立HLP模型，連續(xù)喂養(yǎng)4周。各給藥組大鼠在造模同時即開始灌胃相應藥物，正常組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)4周。末次灌胃后，檢測各組大鼠血清中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平，觀察各組大鼠肝組織病理變化，測定各組大鼠肝組織中AMP活化蛋白激酶1（AMPK）、磷酸化AMPK（p-AMPK）、肝激酶B1（LKB1）、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGCR）蛋白的表達情況。結果 低、中、高劑量珊瑚七十味丸均可顯著降低HLP模型大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平以及肝組織中HMGCR蛋白表達水平（P<0.05），顯著升高HLP模型大鼠血清中HDL-C水平及肝組織中AMPK磷酸化水平、LKB1蛋白表達水平（P<0.05），不同程度地改善HLP模型大鼠肝組織的病理變化。結論 珊瑚七十味丸能降低HLP模型大鼠的血脂水平;其機制可能與抑制LKB1/AMPK信號通路的傳導，從而調節(jié)脂代謝相關。

關鍵詞 珊瑚七十味丸;高脂血癥;肝激酶B1;AMP活化蛋白激酶1;3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）01-0046-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.01.08

ABSTRACT OBJECTIVE To study the effects of Tibetan medicine Shanhu qishiwei pill in lowering blood lipid of hyperlipidemia （HLP） model rats，and to explore its mechanism primarily. METHODS According to their body weigh，60 SD rats were randomly divide into normal group，model group，simvastatin group （positive control，20 mg/kg） and Shanhu qishiwei pill low-dose，medium-dose and high-dose groups （50，100，200 mg/kg），with 10 rats in each group. Normal group was given conventional diet，and other groups were given high-lipid diet to induce HLP model，for consecutive 4 weeks. Administration groups were given relevant medicine intragastrically at the same time of modeling; normal group and model group were given equal volume of normal saline intragastrically，once a day，for consecutive 4 weeks. After last administration，the serum levels of TC，TG，LDL-C and HDL-C were determined; pathological changes of liver tissue were observed; the protein expressions of AMPK，p-AMPK，LKB1，and HMGCR in liver tissue were detected in each group. RESULTS Low-dose，medium-dose and high-dose of Shanhu qishiwei pill could significantly reduce the serum levels of TC，TG and LDL-C and protein expression of HMGCR in liver tissue （P<0.05），while significantly increased serum level of HDL-C，phosphorylation level of AMPK，protein expression of LKB1 in liver tissue in HLP model rats （P<0.05）; the pathological changes of liver tissue in HLP model rats were improved to different extents. CONCLUSIONS Shanhu qishiwei pill can reduce the blood lipid level of HLP model rats，and its mechanism may be related to inhibiting the transmission of LKB1/AMPK signal pathway and regulating lipid metabolism.

KEYWORDS Shanhu qishiwei pill; hyperlipidemia; LKB1; AMPK1; HMGCR

藏醫(yī)藥是中國傳統(tǒng)醫(yī)學的重要組成部分，已經有? ?2 000多年的歷史，并以其獨特的理論體系和豐富的診療方法受到人們的關注。藏藥珊瑚七十味丸出自《四部醫(yī)典》，具有鎮(zhèn)心、安神、定驚、調血之功效，臨床用于冠狀動脈粥樣硬化、心肌梗死、高脂血癥（hyperlipidemia，HLP）和失眠等疾病的治療，而冠狀動脈粥樣硬化、心肌梗死等多種疾病均是HLP的關鍵危險因素[1-3]。隨著人們生活水平的提高及生活習慣的改變，我國HLP的發(fā)病率高達40.40%[4-6]。本團隊前期通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)，珊瑚七十味丸能降低HLP患者總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）等指標;此外，本團隊前期還對珊瑚七十味丸中銅、鉛、鎘、砷、汞5種重金屬含量進行了測定[7]。通過以上研究發(fā)現(xiàn)，珊瑚七十味丸是一種安全、有效的HLP治療藥物。但是，珊瑚七十味丸治療HLP的分子機制尚不清楚，影響了該藥的臨床應用。

目前，越來越多的研究證實，HLP的發(fā)生發(fā)展與肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）/AMP活化蛋白激酶1（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號通路相關。LKB1/AMPK是脂代謝相關通路，其中AMPK蛋白是所有真核生物的中央代謝“開關”，控制葡萄糖和脂質代謝，以響應營養(yǎng)物質和細胞內能量水平的變化[8]。LKB1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可直接磷酸化并激活AMPK，調節(jié)肝臟、肌肉和脂肪等組織的功能，以代謝組織中的脂質、膽固醇和葡萄糖[9]。因此，本研究通過飼喂高脂飼料的方法制備HLP大鼠模型，觀察珊瑚七十味丸對其血脂指標（TC、TG、HDL-C、LDL-C）及LKB1/AMPK信號通路相關蛋白的影響，探討珊瑚七十味丸的降血脂作用及分子機制，為該藥的臨床應用提供實驗依據(jù)，也為其深度開發(fā)奠定基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有BS110S型電子天平（北京賽多利斯天平公司），MR-96TB型酶標儀[騁克儀器（上海）有限公司]，RM2235型石蠟切片機（德國Leica公司），D3024R型臺式高速冷凍型微量離心機[大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司]，YD-6D型組織包埋機、YD-A型組織攤片機、YD-B型組織烤片機（金華市科迪儀器設備有限公司），CX23型光學顯微鏡（日本Olympus公司），NanoDrop2000型超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑有珊瑚七十味丸（西藏雄巴拉曲神水藏藥有限公司，批號2020040302，規(guī)格1 g/丸），辛伐他汀片[華潤雙鶴利民藥業(yè)（濟南）有限公司，批號1810409，規(guī)格10 mg/片]，氨基甲酸乙酯（天津百倫斯生物技術有限公司，批號20200326），TC、TG、HDL-C、LDL-C測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為A110-1-1、A111-1-1、A112-1-1、A113-1-1），兔SP檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號分別為SP-9001、ZLI-9018），BCA蛋白定量檢測試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）制備試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號分別為G2026、G2003），兔抗大鼠AMPK、磷酸化AMPK（p-AMPK）、LKB1、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3 methylglutaryl coenzyme areductase，HMGCR）單克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號分別為bs-10344R、bs-12972R、bs-3948R、bs-5068R），兔抗大鼠β-肌動蛋白（β-actin）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號分別為GB11001、GB23303）;其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

本研究所用動物為健康SD大鼠，共60只（雌雄各半），體質量為180～200 g，鼠齡為8周，由鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場提供，實驗動物生產許可證號為SCXK（豫）2019-0002。本實驗得到了河南中醫(yī)藥大學動物倫理委員會的批準（批準號為DWLL20180018），實驗過程嚴格遵守“3R”原則。實驗期間動物飼養(yǎng)室環(huán)境溫度為20～22 ℃、相對濕度為55%～60%、正常光照，大鼠自由飲水采食。

2 方法

2.1 動物分組、給藥與造模

將60只SD大鼠按體質量隨機分為正常組、模型組、辛伐他汀組（陽性對照，20 mg/kg，為成人臨床給藥劑量的7倍等效劑量）和珊瑚七十味丸低、中、高劑量組（50 、100 、200 mg/kg，分別為成人臨床給藥劑量的3、6、12倍等效劑量），每組10只，雌雄各半。適應性喂養(yǎng)1周后，模型組、辛伐他汀組和珊瑚七十味丸低、中、高劑量組大鼠飼喂高脂飼料（含68%基礎飼料、10%白糖、10%豬油、10%蛋黃粉、2%膽固醇）以制備HLP模型，正常組大鼠飼喂常規(guī)飼料，連續(xù)喂養(yǎng)4周[10]。辛伐他汀組和珊瑚七十味丸低、中、高劑量組大鼠在造模同時即開始灌胃相應藥物進行干預，正常組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，灌胃體積均為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)4周。

2.2 生化指標檢測

末次灌胃后，各組大鼠禁食不禁水12 h，以氨基甲酸乙酯1 g/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，分離（4 ℃，3 000 r/min，10 min）大鼠血清，按照相應試劑盒方法檢測血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。

2.3 病理檢查

采用蘇木精-伊紅（HE）染色法進行檢查。取血后，解剖并取大鼠肝組織。取各組大鼠相同位置的肝組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片（厚度為4 μm），行HE染色，然后將切片置于顯微鏡下觀察肝組織的病理改變。

2.4 肝組織中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白表達情況檢測

2.4.1 免疫組化法檢測 取“2.3”項下肝組織病理切片，經脫蠟、水化后，以H2O2封閉、磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗、檸檬酸鹽緩沖液熱修復8 min后，以山羊血清封閉，室溫孵育30 min;分別滴加AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR抗體（稀釋比例均為1 ∶ 100），4 ℃孵育過夜;加入二抗（稀釋比例為1 ∶ 200），37 ℃孵育20 min;DAB法顯色，自來水沖洗，蘇木精復染3 min，鹽酸乙醇分化;經自來水沖洗、脫水、透明、封片后，在顯微鏡下進行觀察，并采用Image-Pro Plus 6.0軟件測定每個視野中目的蛋白陽性染色（即棕黃色區(qū)域）的積分光密度（integrated optical density，IOD）值，IOD值越高表明目的蛋白的表達水平越高。

2.4.2 Western blot法檢測 取大鼠肝組織適量，加入含1%磷酸酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解液，勻漿后，在4 ℃下以13 000 r/min離心15 min，取上清液，采用BCA蛋白定量法測定上清液中蛋白濃度。將蛋白高溫變性后，取100 μg進行SDS-PAGE（分離膠電壓120 V，濃縮膠電壓75 V，電泳時間2 h），轉移至聚偏二氟乙烯膜（電流300 mA，轉膜時間30 min），5%脫脂奶粉封閉2 h;分別加入AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR一抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000）和β-actin一抗（稀釋比例為1 ∶ 3 000），4 ℃孵育過夜;洗膜后，加入二抗（稀釋比例為1 ∶ 10 000），振蕩孵育1 h;ECL顯影并掃描，通過Image J 1.51軟件測定蛋白條帶灰度值，以LKB1、HMGCR與內參β-actin條帶灰度值的比值表示LKB1、HMGCR蛋白的表達水平，以p-AMPK與AMPK條帶灰度值的比值表示AMPK的磷酸化水平。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，繪圖軟件主要采用GraphPad Prism 7.0。所得實驗數(shù)據(jù)均采用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 珊瑚七十味丸對HLP模型大鼠生化指標的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平均顯著升高（P<0.05），HDL-C水平顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平均顯著降低（P<0.05），HDL-C水平均顯著升高（P<0.05）。各組大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平測定結果見表1。

3.2 珊瑚七十味丸對HLP模型大鼠肝組織病理變化的影響

正常組大鼠肝細胞形狀規(guī)則，呈索狀分布;細胞邊界清晰，胞漿內未見脂肪滴。模型組大鼠肝細胞形態(tài)不規(guī)則，邊界模糊;細胞腫脹且大小不一致，胞漿內可見大量脂肪滴。各給藥組大鼠肝組織的病理變化均較模型組不同程度地改善，胞漿內僅存在少量脂肪滴。各組大鼠肝組織的病理觀察結果見圖1。

3.3 珊瑚七十味丸對HLP模型大鼠肝組織中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白表達的影響

3.3.1 免疫組化實驗結果 與正常組比較，模型組大鼠肝組織中AMPK、p-AMPK、LKB1蛋白的IOD值均顯著降低（P<0.05），HMGCR蛋白的IOD值顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織中AMPK、p-AMPK、LKB1蛋白的IOD值均顯著升高（P<0.05），HMGCR蛋白的IOD值均顯著降低（P<0.05）。各組大鼠肝組織中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白的免疫組化圖見圖2，IOD值測定結果見表2。

3.3.2 Western blot實驗結果 與正常組比較，模型組大鼠肝組織中AMPK磷酸化水平和LKB1蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05），HMGCR蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織中AMPK磷酸化水平和LKB1蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05），HMGCR蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05）。各組大鼠肝組織中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白的電泳圖見圖3，磷酸化水平/蛋白表達水平測定結果見表3。

4 討論

藏藥珊瑚七十味丸具有較好的降血脂作用，該藥由珊瑚、珍珠、瑪瑙、當歸、藏黨參、紅景天、雪蓮花、余甘子、藏紅花、黃精、牛黃、麝香等70味藏藥組成[11]，具有鎮(zhèn)心、安神、定驚、調血之功效，臨床主要用于腦血栓、腦溢血、冠心病、高血壓等病的治療[12-13]。雖然《四部醫(yī)典》中沒有關于藏藥珊瑚七十味丸降血脂作用的相關記載，但由于HLP是心腦血管疾病發(fā)生的重要因素，且臨床研究發(fā)現(xiàn)該藥具有較好的降血脂作用，具有較高的臨床應用價值。辛伐他汀是一種羥甲基戊二酰輔酶A（hydroxymethylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA）還原酶抑制劑，可以有效降低血脂水平，也是目前臨床最為常用的降血脂藥物[14]?；谝陨纤悸罚狙芯恐苽淞薍LP大鼠模型，以辛伐他汀為陽性對照藥物，探討了珊瑚七十味丸對HLP模型大鼠的干預作用。結果發(fā)現(xiàn)，珊瑚七十味丸干預后，HLP模型大鼠血清中TC、TG、LDL-C 水平均顯著降低，HDL-C水平顯著升高。此外，本研究通過HE染色發(fā)現(xiàn)，珊瑚七十味丸各劑量組大鼠肝組織的病理改變程度均明顯減輕?？梢?，珊瑚七十味丸具有明顯的降血脂作用。

AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能參與機體的能量代謝調節(jié)過程，其在肝組織中主要激活LKB1/AMPK通路[15]。當細胞內腺嘌呤核苷一磷酸/腺嘌呤核苷三磷酸升高時，AMPKα亞基上的Thr172位點可被LKB1磷酸化為p-AMPK而激活[8，16-17];p-AMPK則可以通過單磷酸腺苷活化AMPK、HMG-CoA等，從而影響肝組織脂肪酸攝入[18]。本研究采用免疫組化法和Western blot法觀察珊瑚七十味丸對LKB1/AMPK通路相關蛋白表達的影響。免疫組化實驗結果顯示，與模型組比較，珊瑚七十味丸低、中、高劑量組大鼠肝組織中有大量AMPK、p-AMPK、LKB1蛋白沉積，有少量HMGCR蛋白沉積;Western blot法實驗結果顯示，與模型組比較，珊瑚七十味丸低、中、高劑量組大鼠肝組織中AMPK磷酸化水平和LKB1蛋白表達水平均顯著升高，HMGCR蛋白表達水平均顯著降低。兩種方法檢測結果的蛋白表達趨勢一致，說明珊瑚七十味丸可抑制LKB1/AMPK信號通路的傳導。

綜上所述，珊瑚七十味丸可能是通過抑制LKB1/AMPK信號通路的傳導來降低HLP模型大鼠的血脂水平。但由于珊瑚七十味丸藥味繁多，其有效物質并未闡明。在今后的研究中，本課題組將開展其藥效物質基礎研究，為該藥的臨床應用提供依據(jù)。

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（收稿日期：2021-09-09 修回日期：2021-11-30）

（編輯：林 靜）