黃 晶，張藝晴，徐 瑤，鄧禮易，吳濤峰，楊大誠(chéng)，高偉健，藍(lán)銀濤，周夢(mèng)宇，邱 婷，王俐梅，張 建*

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，廣州 511436；2.廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司，廣東省藥物非臨床評(píng)價(jià)研究企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心中藥非臨床評(píng)價(jià)分中心，廣州 510990）

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（retinoblastoma，RB）是嬰幼兒高發(fā)的眼內(nèi)惡性腫瘤［1］，其最常見的發(fā)病位置是玻璃體內(nèi)。RB病的致死率和致盲率高，更嚴(yán)重的是，近年來(lái)RB的發(fā)病率有明顯的上升趨向［2］。近五年，發(fā)達(dá)國(guó)家的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患兒的生存率已經(jīng)達(dá)到90%以上，但是我國(guó)的RB患兒的病死率依舊很高［3］，患兒的視力健康以及生命安全都已拉響了警鐘。RB有著特有的遺傳規(guī)律、較高的退變率和多方向的分化潛力［4］，其相關(guān)研究已成為醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)之一。由于活檢時(shí)腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)大大提升，所以RB的診斷一般不借助于組織病理切片［5］。同時(shí)，電離輻射可以增加攜帶RB1突變基因的患者誘發(fā)第二種原發(fā)性癌癥的概率［6］，因此臨床也通常會(huì)盡量避免使用電子計(jì)算機(jī)斷層掃描。磁共振成像可通過(guò)評(píng)估視神經(jīng)的侵襲進(jìn)而推測(cè)RB的存在［7-8］，但受限于分辨率，其很難直接可視化眼內(nèi)的RB細(xì)胞。現(xiàn)階段眼科醫(yī)生仍然主要通過(guò)檢眼鏡檢查眼底，但該診斷手法的準(zhǔn)確性比較依賴于醫(yī)生的專業(yè)水平以及經(jīng)驗(yàn)。因此，RB的診斷和治療需要新型的影像技術(shù)和合適的動(dòng)物模型。

近年來(lái)，斑馬魚（Danio rerio）已然成為了一種研究人類疾病的優(yōu)良模式動(dòng)物，其與人類基因的同源性高達(dá)85%，且在組織器官發(fā)育起源及發(fā)育過(guò)程等方面都具有高度的同源性。同時(shí)，斑馬魚具有繁殖能力強(qiáng)、體外受精體外發(fā)育、胚胎透明易觀察、生長(zhǎng)發(fā)育快等生理優(yōu)勢(shì)［9］，被大量應(yīng)用于癌癥研究、藥物研究、遺傳研究及心理研究等［10］，其中就包括視網(wǎng)膜疾病的研究。與其他動(dòng)物模型相比，斑馬魚的視網(wǎng)膜并不停止發(fā)育，成熟斑馬魚的視網(wǎng)膜仍然具有增殖的能力，所有類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞都能不斷從睫狀緣的周圍發(fā)生中心產(chǎn)生；斑馬魚視錐細(xì)胞也能不斷地由視錐祖細(xì)胞生成，具有顯著的再生能力［11］。當(dāng)斑馬魚視網(wǎng)膜受到人為破壞時(shí)很少死亡，并能自身愈合傷口，其成活率較高［12-13］。因此，在斑馬魚玻璃體下植入RB細(xì)胞后，其良好的再生機(jī)制有利于我們觀察RB細(xì)胞在斑馬魚玻璃體中的分布及存活的情況。

光學(xué)相干層析成像（optical coherence tomography，OCT）是一種可以實(shí)時(shí)成像、低損、高層析度、高分辨度、非侵入性的醫(yī)學(xué)成像技術(shù)［14-16］。相較于體視顯微鏡成像的雙通道光路成像原理，光學(xué)相干層析術(shù)基于弱相干光干涉儀的基本原理具有更強(qiáng)的層析能力，可檢測(cè)生物組織不同深度層面對(duì)入射弱相干光的背向反射或散射信號(hào)的強(qiáng)度，通過(guò)掃描可以得到生物的二維或三維組織成像［17-19］。OCT能夠利用眼中不同組織對(duì)光的不同反射，進(jìn)而分析并顯現(xiàn)出組織的斷面結(jié)構(gòu)。之前的研究表明，OCT十分適合成年斑馬魚的生命科學(xué)研究［20-22］。根據(jù)成像目的、病變位置等可以選擇合適的OCT掃描方式如水平、垂直、環(huán)形、放射狀等不同的角度進(jìn)行線性掃描。目前，OCT已經(jīng)被應(yīng)用于探測(cè)人體軟組織的早期癌變，相對(duì)于活組織檢查更加快速清晰。另外，OCT不僅可用于監(jiān)測(cè)眼部黃斑腫瘤和局灶復(fù)發(fā)的情況［23］，還可以用于檢測(cè)糖尿病性視網(wǎng)膜病變、青光眼等疾?。?4］。斑馬魚視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物結(jié)構(gòu)相似，其結(jié)構(gòu)由里到外包含內(nèi)界膜、神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)網(wǎng)織層、內(nèi)顆粒層、外網(wǎng)織層、外顆粒層、色素細(xì)胞上層和感光層、脈絡(luò)膜、毛細(xì)血管［25］。哺乳動(dòng)物（以人為代表）的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)由里到外包含內(nèi)界膜、神經(jīng)纖維層、節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)網(wǎng)層、內(nèi)核層、外網(wǎng)層、外核層、外界膜、視桿視錐層、色素上皮層。已有文獻(xiàn)建立了RB斑馬魚的模型，但是尚未見到使用OCT監(jiān)測(cè)方法對(duì)模型進(jìn)行監(jiān)測(cè)?；谝陨希覀償M構(gòu)建玻璃體RB斑馬魚模型，并利用OCT技術(shù)對(duì)該模型的RB細(xì)胞擴(kuò)散過(guò)程進(jìn)行活體、無(wú)損的動(dòng)態(tài)成像，同時(shí)利用體視熒光成像（stereo fluorescence microscope，SFM）同步觀察來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證OCT成像結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本研究隨機(jī)選取了24條大小一致的正常斑馬魚作為研究對(duì)象，其中21條魚用于構(gòu)建RB斑馬魚模型，剩余3條魚作為對(duì)照。正常情況下拍攝斑馬魚右眼的OCT圖像和體視顯微鏡圖像后，將這24條斑馬魚分別編號(hào)并置于不同容器中培養(yǎng)。斑馬魚的生活環(huán)境均相同，其飼養(yǎng)環(huán)境為（28±0.5）℃的水體，給予周期為14 h和10 h的明暗光照。

1.2 試驗(yàn)儀器

臺(tái)式低速離心機(jī)（型號(hào)：L530）購(gòu)自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；醫(yī)用凈化工作臺(tái)（型號(hào)：SW-CJ-2F）購(gòu)自蘇州市蘇杭科技器材有限公司；可調(diào)移液器（1 000 μL、10 μL～100 μL）購(gòu)自上海奧陸生物科技公司；二氧化碳培養(yǎng)箱（型號(hào)：3543）購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；體視顯微鏡（型號(hào)：XTT-B3）購(gòu)自上海譜騫光學(xué)儀器有限公司；SFM顯微鏡（型號(hào)：TL5000 Ergo）購(gòu)自德國(guó)徠卡公司；OCT儀（規(guī)格：HSO-3000）購(gòu)自深圳市生強(qiáng)科技有限公司。

本研究采用的是頻域OCT系統(tǒng)，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。本OCT系統(tǒng)的光源發(fā)射器件是波長(zhǎng)為840 nm的超輻射發(fā)光二極管（superluminescent diode，SLD），掃描范圍為2～15 mm，最大二維掃描速度為32 f/s，軸向掃描頻率為18 kHz。經(jīng)過(guò)測(cè)量，本系統(tǒng)軸向分辨率約為8 μm，橫向分辨率約為12 μm，成像深度可達(dá)2 mm左右。它利用寬帶光源的低相干性，通過(guò)反射鏡位置與相應(yīng)的后向散射光干涉信號(hào)強(qiáng)度獲得樣品不同深度的測(cè)量數(shù)據(jù)，對(duì)生物組織內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行高分辨率層析成像。其核心部件是寬帶光源照明的邁克爾遜干涉儀和光譜儀，相較于時(shí)域OCT系統(tǒng)，其記錄的后向散射光的強(qiáng)度僅作為光譜頻率而不是時(shí)間的函數(shù)，極大地提高了獲取速度。同時(shí)譜域OCT信號(hào)在光譜密度中作為一個(gè)傅立葉重構(gòu)的結(jié)果被采樣，改善了信噪比。

圖1 光學(xué)相干層析成像系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of optical coherence tomography system

1.3 綠色熒光蛋白標(biāo)記的RB細(xì)胞

本研究所用的RB細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American Type Culture Collection，ATCC），采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法讓細(xì)胞可以表達(dá)綠色熒光蛋白，將穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞凍存在-80℃冰箱中。在斑馬魚建模前3 d復(fù)蘇綠色熒光蛋白標(biāo)記的RB細(xì)胞并傳代，保證其生長(zhǎng)狀態(tài)良好。待綠色熒光蛋白標(biāo)記的RB細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，離心后重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液按照1∶2～1∶4傳代，然后接種于2～4個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適當(dāng)培養(yǎng)液，置于37℃、相對(duì)濕度95%、CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)培養(yǎng)液顏色發(fā)生變化或者培養(yǎng)基內(nèi)雜質(zhì)過(guò)多時(shí)更換培養(yǎng)液。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)、計(jì)數(shù)、離心，用不含血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度分別為1.0×107、2.0×107、3.0×107個(gè)/mL備用。

1.4 試劑配制

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的Tricaine溶液（麻醉劑）：Tricaine（西格瑪，A5040，美國(guó)）粉末溶于Holtbuffer緩沖液中，配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.40%的儲(chǔ)備液，試驗(yàn)前需將儲(chǔ)備液加過(guò)濾水稀釋到0.01%，即得到麻醉所用的工作液。

1.5 玻璃體腫瘤斑馬魚模型的構(gòu)建

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)、計(jì)數(shù)、離心，用不含血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度分別為1.0×107、2.0×107、3.0×107個(gè)/mL。經(jīng)多次反復(fù)試驗(yàn)觀察得出，當(dāng)熒光細(xì)胞懸液密度約2.0×107個(gè)/mL時(shí)，其在熒光體視顯微鏡或OCT中的成像均清晰可見，呈現(xiàn)出顆粒狀細(xì)胞團(tuán)。因此，本研究最終選用密度為2.0×107個(gè)/mL綠色熒光蛋白標(biāo)記的RB細(xì)胞懸液用于模型構(gòu)建，注入20 μL該懸液至斑馬魚右眼的玻璃體內(nèi)。

注射RB細(xì)胞前，首先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的Tricaine溶液將斑馬魚麻醉，然后對(duì)其進(jìn)行先右后左、由外向內(nèi)的眼科外觀檢查，確保眼眶無(wú)外傷、紅腫，玻璃體無(wú)增大、變小、凸出、內(nèi)陷、偏斜、震顫等異?，F(xiàn)象。隨后將斑馬魚擺放在玻璃皿中，右眼朝上，左眼朝下，在OCT引導(dǎo)下將RB細(xì)胞懸液用微量注射器注射到其右眼玻璃體中。為了保證斑馬魚造模時(shí)處于一個(gè)相對(duì)濕潤(rùn)的環(huán)境，實(shí)施該過(guò)程時(shí)應(yīng)在斑馬魚上下方都鋪墊濕潤(rùn)的紙巾。

1.6 RB細(xì)胞植入后斑馬魚的飼養(yǎng)

成功植入綠色熒光蛋白標(biāo)記的RB細(xì)胞后，將斑馬魚按原有的編號(hào)順序放置回對(duì)應(yīng)的容器里面，同時(shí)保證飼養(yǎng)水環(huán)境相對(duì)潔凈，水更換周期為2 d/次，每次換水時(shí)應(yīng)注意要保留1/3的原有水，再添加2/3的潔凈飼養(yǎng)水。同時(shí)，試驗(yàn)期間給予斑馬魚適量的活蝦卵，保證所有斑馬魚能成功進(jìn)食，并且盡量保證每一條斑馬魚的進(jìn)食量相同。

1.7 OCT成像斑馬魚眼睛

將已麻醉的斑馬魚擺放在玻璃皿中，右眼朝上，左眼朝下。玻璃皿放置于OCT系統(tǒng)下，對(duì)斑馬魚玻璃體植入細(xì)胞前后進(jìn)行OCT活體成像。按試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案對(duì)造模后的斑馬魚的玻璃體內(nèi)RB細(xì)胞進(jìn)行活體監(jiān)測(cè)，從而獲得擴(kuò)散現(xiàn)象的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)。

1.8 SFM成像斑馬魚眼睛

將已麻醉的斑馬魚擺放在玻璃皿中，右眼朝上，左眼朝下。玻璃皿放置于SFM系統(tǒng)下，對(duì)斑馬魚玻璃體植入RB細(xì)胞前后進(jìn)行SFM活體成像。按試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案對(duì)造模后的斑馬魚的玻璃體內(nèi)RB細(xì)胞進(jìn)行活體監(jiān)測(cè)，從而獲得擴(kuò)散現(xiàn)象的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)。

1.9 測(cè)量和統(tǒng)計(jì)方法

RB細(xì)胞在OCT圖像和SFM圖像中的強(qiáng)度和分布面積均是使用專業(yè)軟件MATLAB在圖像上測(cè)量獲取的。收集的數(shù)據(jù)通過(guò)Origin處理分析，基于定量數(shù)據(jù)說(shuō)明RB細(xì)胞在玻璃體中的存活狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 建模過(guò)程中斑馬魚的行為學(xué)表現(xiàn)

RB細(xì)胞注射進(jìn)入玻璃體后，立刻將斑馬魚轉(zhuǎn)移到飼養(yǎng)水中，并放入增氣泵。所有模型組斑馬魚都在建模后30 s內(nèi)自行蘇醒。與正常斑馬魚相比，模型組斑馬魚游動(dòng)無(wú)異常，但由于視網(wǎng)膜有一定程度的受損，因此模型組斑馬魚視力有一定程度的下降，對(duì)懸浮在水面的魚飼料無(wú)反應(yīng)，但對(duì)在水中活動(dòng)的活蝦卵有進(jìn)食反應(yīng)。

2.2 造模前后斑馬魚眼睛的OCT和SFM成像結(jié)果

RB細(xì)胞注射前斑馬魚玻璃體的OCT圖像如圖2a所示，建模后斑馬魚玻璃體的OCT圖像如圖2b所示，兩圖均為玻璃體的橫切面。對(duì)比這兩幅圖可以清晰地看到綠色圓圈中從建模前的全黑到建模成功后的暗黃色亮點(diǎn)，這是由于RB細(xì)胞團(tuán)的高光散射特性導(dǎo)致的OCT信號(hào)強(qiáng)度增大。正常斑馬魚玻璃體的熒光體視顯微鏡圖像如圖2c所示，建模后斑馬魚玻璃體的熒光體視顯微鏡圖像如圖2d所示，兩圖均為玻璃體的面成像結(jié)果，成像深度為斑馬魚玻璃體內(nèi)部一個(gè)薄的焦平面。對(duì)比兩圖，可清晰看到綠色圓圈內(nèi)的細(xì)胞團(tuán)樣熒光顆粒，說(shuō)明綠色熒光蛋白標(biāo)記的RB細(xì)胞成功植入到斑馬魚玻璃體內(nèi)。由于OCT圖中斑馬魚骨骼的強(qiáng)度過(guò)高，導(dǎo)致細(xì)胞團(tuán)的對(duì)比度較差，故接下來(lái)利用虛擬切片對(duì)OCT圖像進(jìn)行了分割重建。

圖2 斑馬魚玻璃體注射前后的OCT圖像與對(duì)應(yīng)的SFM圖像Fig.2 OCT images of zebrafish vitreous body before and after injection as well as SFM images

2.3 斑馬魚玻璃體內(nèi)RB細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程的OCT與SFM長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)

斑馬魚的玻璃體內(nèi)植入RB細(xì)胞后，我們利用OCT和SFM對(duì)如圖3a所示的斑馬魚進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)72 h的監(jiān)控，以確保覆蓋一個(gè)細(xì)胞的繁殖周期。圖3b是玻璃體內(nèi)注射RB細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)的OCT圖，圖3c是玻璃體注射RB細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)的SFM圖。為了更好地與SFM結(jié)果相匹配對(duì)應(yīng)，OCT圖像采用投影方法將眼球的三維數(shù)據(jù)壓縮到一個(gè)二維圖像上，這樣做可以讓分散在整個(gè)玻璃體內(nèi)部的RB細(xì)胞分布情況都顯示出來(lái)。對(duì)照觀察OCT和SFM圖像可以發(fā)現(xiàn)，在0 h時(shí)，綠色熒光蛋白標(biāo)記的RB細(xì)胞在玻璃體內(nèi)植入成功，通過(guò)OCT與SFM成像均可觀察到腫瘤團(tuán)樣。在24 h的 OCT圖和SFM圖中可以明顯地觀察出RB細(xì)胞數(shù)量減少。相較于SFM圖，OCT圖能觀察出綠色熒光蛋白標(biāo)記的RB細(xì)胞在玻璃體內(nèi)零落分布的情況。而SFM圖并不能明顯分辨出小顆粒的熒光細(xì)胞團(tuán)，圖中發(fā)光的邊緣區(qū)域呈現(xiàn)的光亮由發(fā)亮的熒光綠演變?yōu)殪F狀感的綠色。在48 h的 OCT圖和SFM圖中依舊可以明顯地觀察出RB細(xì)胞數(shù)量減少。與24 h的圖對(duì)比，OCT圖能觀測(cè)到綠色熒光蛋白標(biāo)記的RB細(xì)胞分布的區(qū)域減少，但個(gè)別亮點(diǎn)的面積有增大的現(xiàn)象，SFM圖的亮綠熒光區(qū)域減少較多，霧狀感的綠色區(qū)域也大幅減少。72 h時(shí)，SFM圖可以觀察到RB細(xì)胞繼續(xù)減少，熒光幾乎無(wú)法看到，而OCT圖能明顯觀察到中心橙黃色亮點(diǎn)的面積有增大的現(xiàn)象。綜上所述，OCT圖與SFM圖表現(xiàn)出來(lái)的綠色熒光蛋白標(biāo)記的RB細(xì)胞存活狀態(tài)整體情況一致，但OCT能反映出一些體視顯微鏡觀察不明顯的細(xì)節(jié)，如中心綠色熒光蛋白標(biāo)記的RB細(xì)胞團(tuán)在72 h相較于48 h增大的現(xiàn)象。

圖3 OCT與SFM活體監(jiān)控斑馬魚玻璃體注射后熒光細(xì)胞的分布情況Fig.3 OCT and SFM in vivo monitoring the distribution of the living fluorescent cells in vitreous body

2.4 定量分析OCT圖像評(píng)估RB細(xì)胞的存活情況

定量的數(shù)據(jù)可以更加客觀地顯現(xiàn)出視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤斑馬魚細(xì)胞的存活情況，因此，我們從成功建模的斑馬魚中選取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OCT圖像并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，以評(píng)估玻璃體內(nèi)細(xì)胞存活數(shù)量和癌干細(xì)胞的分布情況。圖4a為斑馬魚玻璃體進(jìn)行OCT的三維壓縮二維圖像。圖4b是通過(guò)閾值法將噪聲背景去掉后的結(jié)果。圖4c為圖4a灰度處理后進(jìn)行二值化后的圖像。通過(guò)該處理，我們可以直觀地觀察到斑馬魚玻璃體內(nèi)的RB細(xì)胞分布。該過(guò)程呈現(xiàn)的趨勢(shì)為斑馬魚玻璃體內(nèi)RB細(xì)胞數(shù)量整體下降，但中心集聚的RB細(xì)胞團(tuán)在24～72 h內(nèi)可觀察到一定程度的面積增大。圖4d在圖4a的基礎(chǔ)上進(jìn)行了RB細(xì)胞團(tuán)凸顯處理，將亮度低、活性不強(qiáng)的細(xì)胞篩選出去。通過(guò)該處理，我們能觀察到0～24 h的RB細(xì)胞由于機(jī)體內(nèi)免疫系統(tǒng)的作用及環(huán)境變換，短時(shí)間內(nèi)大部分失活死亡。RB細(xì)胞團(tuán)會(huì)在玻璃體內(nèi)進(jìn)行無(wú)規(guī)則運(yùn)動(dòng)，中心RB細(xì)胞團(tuán)有移動(dòng)、擴(kuò)大的趨勢(shì)。

圖4 OCT圖像處理后結(jié)果Fig.4 The result of OCT images processing

進(jìn)一步分析不同時(shí)間點(diǎn)的OCT圖像和SFM圖像結(jié)果，對(duì)玻璃體內(nèi)RB細(xì)胞分布面積作出點(diǎn)線圖（圖5）。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，玻璃體內(nèi)RB細(xì)胞的分布面積在0～24 h中呈現(xiàn)迅速下降的趨勢(shì)，不同的是，OCT結(jié)果顯示的下降速度要大于SFM結(jié)果。50 h后的OCT結(jié)果與SFM結(jié)果基本一致，均顯示RB細(xì)胞面積不再縮小。在此基礎(chǔ)上，我們對(duì)OCT圖像和SFM圖像中RB細(xì)胞的亮度情況進(jìn)行了定量分析（圖6）。SFM結(jié)果顯示玻璃體內(nèi)RB細(xì)胞的光強(qiáng)度在72 h內(nèi)持續(xù)下降，OCT結(jié)果顯示0～24 h RB細(xì)胞的光強(qiáng)度先上升，隨后持續(xù)下降。

圖5 定量分析玻璃體內(nèi)RB細(xì)胞存活數(shù)量的變化過(guò)程Fig.5 Quantitative analysis of the changes in the number of RB cell in the vitreous body

圖6 定量分析玻璃體內(nèi)RB細(xì)胞光強(qiáng)度的變化情況Fig.6 Quantitative analysis of the optical intensity of RB cell in the vitreous body

3 討論

斑馬魚眼睛的形態(tài)、解剖結(jié)構(gòu)以及其控制眼睛發(fā)育的基因表達(dá)等方面與人類存在著極大的相似性，其現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于眼部疾病的研究。眼部疾病是全球范圍內(nèi)備受關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，目前研究眼睛的手段有經(jīng)典的眼底熒光素血管造影、鈣化檢測(cè)、病理檢測(cè)等。但現(xiàn)存的方法都存在自身的局限性，組織病理學(xué)檢查不僅步驟繁瑣，而且可能還會(huì)發(fā)生RB細(xì)胞轉(zhuǎn)移等，其他影像技術(shù)有些存在輻射損傷，可能會(huì)促使攜帶病變基因的患者誘發(fā)原發(fā)性癌癥等。OCT技術(shù)已經(jīng)成為一種眼部疾病的診斷的金標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用在臨床上，得益于高分辨率、成像速度快的優(yōu)點(diǎn)，其在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用也在快速拓展［12,26］。SFM技術(shù)的對(duì)比度高，被廣泛應(yīng)用于RB細(xì)胞的增殖和遷移研究［27］。

本研究利用OCT和SFM成像技術(shù)對(duì)RB細(xì)胞植入斑馬魚玻璃體以及隨后的擴(kuò)散過(guò)程進(jìn)行活體監(jiān)測(cè)。根據(jù)數(shù)據(jù)可以推測(cè)出斑馬魚玻璃體綠色熒光蛋白標(biāo)記的RB細(xì)胞總體數(shù)量呈線性下降。在0～24 h之間，RB細(xì)胞受免疫系統(tǒng)影響不大，由分散狀態(tài)做一定運(yùn)動(dòng)聚集在一起，其數(shù)量和活性有一定的上升趨勢(shì)；24～72 h時(shí)，玻璃體內(nèi)整體的RB細(xì)胞對(duì)該環(huán)境不太適應(yīng)，且有免疫系統(tǒng)的作用，其數(shù)量和活性都下降且呈線性關(guān)系。Chen等［28］的研究表明，SFM技術(shù)可以監(jiān)控?zé)晒鈽?biāo)記的RB細(xì)胞在斑馬魚體內(nèi)的轉(zhuǎn)移，RB細(xì)胞注射進(jìn)入斑馬魚眼睛后的面積會(huì)在10 d內(nèi)逐漸減小，該結(jié)果與本研究一致。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，建模后斑馬魚玻璃體內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的光亮強(qiáng)度表現(xiàn)得不一樣，且光強(qiáng)較強(qiáng)的細(xì)胞存活時(shí)間也更久，因此我們推測(cè)這些細(xì)胞是RB細(xì)胞團(tuán)里面的癌癥干細(xì)胞。本研究目前存在一些問(wèn)題。一個(gè)問(wèn)題是RB細(xì)胞在斑馬魚玻璃體內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程不統(tǒng)一。具體來(lái)講，21條模型斑馬魚中的15條魚玻璃體注射24 h后，OCT和SFM就不能檢測(cè)到RB細(xì)胞團(tuán)，又有4條魚在注射48 h后，RB細(xì)胞團(tuán)消失，最終僅剩2條魚可以在72 h檢測(cè)到RB細(xì)胞增多的現(xiàn)象。接下來(lái)，研究組將在如何提高RB細(xì)胞的成活率方面進(jìn)一步開展工作。另一個(gè)問(wèn)題是OCT和SFM定量結(jié)果在24 h的時(shí)候存在不一致的情況。我們認(rèn)為有兩方面原因：一是SFM成像的焦深不夠，以至于不能顯示玻璃體內(nèi)全部RB細(xì)胞的熒光圖像；二是OCT成像的分辨率還要進(jìn)一步提高，以檢測(cè)到分散的RB細(xì)胞。

綜上所述，OCT技術(shù)能精準(zhǔn)無(wú)損地活體評(píng)估斑馬魚視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的存在狀態(tài)和擴(kuò)散過(guò)程，獲得的OCT圖像質(zhì)量可以和SFM圖像質(zhì)量相媲美。由于OCT技術(shù)有較強(qiáng)的層析能力，對(duì)比SFM來(lái)說(shuō)，甚至有更直觀的觀察優(yōu)勢(shì)。我們相信，OCT技術(shù)的實(shí)時(shí)性、安全性、無(wú)創(chuàng)性和可靠性在眼睛研究方面具有廣闊的應(yīng)用前景，特別是在眼內(nèi)腫瘤疾病的演化過(guò)程研究方面具有明顯的研究?jī)?yōu)勢(shì)。