潘 越，宋武琦，張鳳民，劉海亮

（哈爾濱醫(yī)科大學醫(yī)學微生物學教研室，哈爾濱醫(yī)科大學伍連德研究所，哈爾濱 150081）

關(guān)鍵字：發(fā)光二極管；M1型巨噬細胞極化；單核細胞；STAT1；核轉(zhuǎn)位

巨噬細胞（macrophage）作為天然免疫中最有效的細胞類型之一，可以調(diào)節(jié)宿主防御和體內(nèi)炎癥反應平衡［1］。其具有強大的細胞吞噬、抗原呈遞和分泌細胞因子的能力，可控制先天性免疫和適應性免疫的起始和消退［2］。針對不同的局部微環(huán)境，靜息巨噬細胞（M0型）可以極化為經(jīng)典活化型巨噬細胞（M1型）和替代活化型巨噬細胞（M2型）［3］。M1型巨噬細胞是抵抗細胞內(nèi)病原體和抑制腫瘤生長的關(guān)鍵效應細胞，M2型巨噬細胞與免疫抑制、促進組織重塑和腫瘤進展有關(guān)［4-6］。M1/M2型巨噬細胞比例的精確調(diào)節(jié)可以改變組織內(nèi)的微環(huán)境，在自身免疫性疾病、慢性炎癥性疾病和腫瘤中發(fā)揮重要作用，并且對疾病的預后及轉(zhuǎn)歸起關(guān)鍵性作用。調(diào)控巨噬細胞極化是藥物治療的重要手段，因此調(diào)控巨噬細胞極化的分子可作為治療巨噬細胞極化相關(guān)疾病的重要靶點［7］。許多轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控巨噬細胞極化中起重要作用，如干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factor，IRF）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor，NF-κB）、信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）等［8］。Jiang等［9］報道了T細胞 Ig黏蛋白3（T cell Ig mucin-3 ，TIM-3）可通過Y256和Y263殘基與 JAK競爭結(jié)合STAT1，抑制STAT1的磷酸化和核轉(zhuǎn)位，從而抑制巨噬細胞中的STAT1-miR-155信號軸，促進巨噬細胞極化為 M2 表型。Ding等［10］發(fā)現(xiàn)，酸棗仁甙D能抑制STAT1的激活和核轉(zhuǎn)位，同時增強STAT6的核轉(zhuǎn)位，促進巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)化，從而調(diào)節(jié)巨噬細胞M1/M2極化。這些研究發(fā)現(xiàn)了STAT1 在調(diào)控巨噬細胞極化中起關(guān)鍵作用，為治療相關(guān)疾病提供了科學有效的解決方案。

光生物調(diào)節(jié)（photobiomodulation，PBM）是一個發(fā)展較快的生物醫(yī)學研究領(lǐng)域，如使用低功率密度的紅光或近紅外光能對細胞或組織產(chǎn)生有益影響［11］。與傳統(tǒng)的激光光源療法相比，發(fā)光二極管（light-emitting diode，LED）光療法的優(yōu)勢在于可以提供大型平面陣列照射大面積身體區(qū)域［12］。除此之外，LED與激光相比還具有發(fā)光波長涵蓋范圍廣、光轉(zhuǎn)換效率高、可以以脈沖的形式輸出、操作便利、使用成本低、安全、可靠、適宜進行專用的醫(yī)學設(shè)計等優(yōu)點。鑒于這些特點，LED在醫(yī)療應用和光生物調(diào)節(jié)中得到了迅速發(fā)展。LED光療已被證實在多種臨床適應癥中均有效，如減輕疼痛、促進傷口愈合、嫩膚、緩解過敏性鼻炎等［12］。Cheong等［13］報道了850 nm LED照射能夠抑制T細胞誘導的細胞因子表達。Kim等［14］證明了633 nm LED照射會增加I型前膠原的合成，并降低皮膚成纖維細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶的表達。本課題組前期研究結(jié)果證實，630 nm LED照射可能通過TRPV4/PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制人滑膜細胞的增殖［15］，同時，630 nm LED照射能抑制巨噬細胞產(chǎn)生促炎癥因子，從而發(fā)揮抗炎作用［16］。然而，630 nm LED照射對于巨噬細胞極化的作用及其機制尚未報道，故本研究對630 nm LED照射對人髓系白血病單核細胞（human acute monocytic leukemia，THP-1）來源的M1型巨噬細胞極化的影響進行評價，探討其對M1型巨噬細胞極化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及630 nm LED照射處理

將THP-1培養(yǎng)在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Gibco，USA）、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco，USA）中，于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。THP-1細胞于100 nmol/L佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA，Solaribio，中國北京）中孵育24.0 h，將其分化為巨噬細胞（M0型），更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24.0 h。用20 ng/mL干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ，peprotech，USA）和100 ng/mL 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，Sigma，USA）刺激M0型巨噬細胞18.0 h，使其極化為M1型。LED照射組在誘導極化的第14小時對細胞進行630 nm LED照射，每2.0 h照射1次，每次10 min，共照射3次。本研究使用的630 nm LED 照射燈板由北京創(chuàng)盈光電科技有限公司研制。

1.2 細胞活性測定（MTT、CCK-8、LDH）

THP-1細胞以1×104個/孔接種在96孔板中，根據(jù)試驗條件培養(yǎng)細胞和LED照射處理后，在每孔中加入20 μL 4 mg/mL的噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）溶液，37℃孵育3.5 h后棄掉培養(yǎng)基，每孔中加入200 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）37℃ 孵育30 min，在波長為570 nm處測量吸光度。細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）檢測細胞活性，每孔中加入10 μL CCK-8溶液，37℃孵育4.0 h，在波長為450 nm處測量吸光度。乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）活性檢測參照試劑盒說明書操作（Solarbio, 中國北京），在波長為450 nm處測量吸光度。

1.3 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）

收集照射后的細胞，用Trizol法（Invitrogen，USA）提取細胞的總RNA，用HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒（康為世紀，中國）逆轉(zhuǎn)錄2 μg總RNA，反應體系和反應程序參照試劑盒說明書。用ChamQ Universal SYBR qPCR Mix（諾唯贊生物，中國）和引物（10 μmol/L，庫美生物，中國）進行擴增反應。以β-actin為參照基因進行歸一化，采用閾值循環(huán)法計算目的基因的表達量。實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）試驗數(shù)據(jù)中各基因在各樣本組細胞中的表達量用循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）表示，采用 2-ΔΔCT法表示 LED 照射組與對照組目的基因mRNA的相對表達量，引物序列如表1。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 The primer sequences of RT-qPCR

1.4 蛋白質(zhì)提取和免疫印跡分析

收集照射后的細胞，用細胞核漿蛋白提取試劑盒（Solarbio，中國）分離細胞核和漿蛋白。用BCA蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime，中國）進行蛋白濃度測定后，將樣品置于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠上分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）上轉(zhuǎn)膜（300 mA 恒流，1.5 h），5%脫脂牛奶封閉1.0 h，抗體4℃過夜。主要抗體為STAT1（Cell Signal Technology，USA）、Histone H3（Cell Signal Technology，USA）、GAPDH（Cell Signal Technology，USA），抗體稀釋倍數(shù)均為1∶1 000，一抗孵育后用Tris-HCl緩沖液（Tris-buffered saline tween，TBST）洗膜3次，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1.0 h，TBST洗膜3次后加入電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑顯色（Affinity，中國），進行凝膠顯影成像。

1.5 細胞免疫熒光

試驗前準備封閉緩沖液（1×PBS/5% BSA/0.3%Triton X-100）和抗體稀釋緩沖液（1×PBS/1%BSA/0.3% Triton X-100）。細胞經(jīng)LED照射處理后，用預冷的4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次，在封閉緩沖液中封閉1.0 h，吸去封閉緩沖液，加入用抗體稀釋緩沖液稀釋的一抗STAT1（1:200），4℃孵育過夜。用PBS 漂洗3次，用抗體稀釋緩沖液稀釋熒光二抗（1∶100，F(xiàn)ITC Goat Anti-Rabbit IgG，ABclonal，中國），室溫下避光孵育標本1.0 h，PBS 漂洗3次，用4，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole， DAPI）染核10 min，PBS漂洗3次后用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 630 nm LED照射對THP-1來源的M1型巨噬細胞活性的影響

為確定630 nm LED照射對于THP-1來源的M1型巨噬細胞活性的影響，我們分別采用CCK-8、MTT、LDH法對細胞活性進行測定。圖1a為試驗照射過程。圖1b～1d結(jié)果顯示，與對照組相比，630 nm LED照射（40.02 mW/cm2）對細胞活性無顯著影響［所有試驗重復3次，結(jié)果以均數(shù)±標準誤（n=3）表示］。因此，在不影響巨噬細胞活性的條件下，后續(xù)試驗均采用此照射條件探討LED對巨噬細胞極化的作用。

圖1 630 nm LED照射對THP-1來源的M1型巨噬細胞活性的影響Fig.1 Effects of 630 nm LED on THP-1-derived M1 macrophages viability

2.2 630 nm LED照射抑制M1型巨噬細胞相關(guān)因子的mRNA表達

RT-qPCR法檢測630 nm LED照射對M1型巨噬細胞相關(guān)基因表達的影響。圖2結(jié)果顯示，M1組的CD80、白介素6（interleukin 6，IL-6）、白介素23（Interleukin 23，IL-23）、干擾素調(diào)節(jié)因子5（interferon regulatory factor 5，IRF5）、趨化因子配體9（C-X-C motif chemokine ligand ，CXCL9）、CXCL10、CXCL11明顯高于M0組，表明M0巨噬細胞經(jīng)LPS和干擾素作用18.0 h后已極化為M1型巨噬細胞（****P＜0.000 1）。圖2a～2d顯示，LED照射處理組中CD80、白介素1β（interleukin 1，IL-1β）、IL-6、IL-23的 mRNA表達與對照組相比無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。圖2e～2h結(jié)果顯示，LED照射處理組中IRF5、CXCL9、CXCL10、CXCL11mRNA的表達較M1對照組顯著降低（*P＜0.05，**P＜0.01）。結(jié)果表明，630 nm LED照射可抑制M1型巨噬細胞的極化。

圖2 630 nm LED照射抑制M1型巨噬細胞相關(guān)基因mRNA的表達Fig.2 630 nm LED irradiation inhibits M1 macrophage-related mRNA expression

2.3 630 nm LED照射抑制M1型巨噬細胞核蛋白中STAT1蛋白的表達

在巨噬細胞中，STAT1轉(zhuǎn)位至細胞核，從而與DNA結(jié)合促進巨噬細胞向M1型極化。本研究從M0、M1、M1+LED三組細胞中提取總蛋白，用免疫印跡法檢測巨噬細胞總STAT1的蛋白水平。如圖3a所示，M1組與M0組相比，巨噬細胞總蛋白中STAT1水平升高，而照射處理組與M1組STAT1沒有顯著差異（**P＜0.01）。將三組細胞進行核漿蛋白分離，以GAPDH和Histone分別作為漿蛋白和核蛋白的內(nèi)參，用免疫印跡法進一步檢測M1型巨噬細胞核漿蛋白中STAT1的表達水平。如圖3b所示，M1組巨噬細胞核蛋白中的STAT1較M0組其相對表達量明顯升高，而經(jīng)630 nm LED照射處理后，核蛋白中STAT1的相對表達量降低（圖3b中左側(cè)的三組）（*P＜0.05，***P＜0.001）。在LED照射處理組中，漿蛋白STAT1的表達量與M1組相比無統(tǒng)計學意義（圖3b中右側(cè)的三組）。結(jié)果表明，630 nm LED光照不影響巨噬細胞總STAT1的表達水平，但可抑制巨噬細胞中STAT1向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。

圖3 630 nm LED照射抑制M1型巨噬細胞核蛋白中STAT1蛋白表達Fig.3 630 nm LED irradiation inhibits nuclear STAT1 expression in M1 macrophages

2.4 630 nm LED照射抑制M1型巨噬細胞中STAT1向核內(nèi)轉(zhuǎn)移

免疫熒光檢測結(jié)果顯示，未用LPS和IFN-γ刺激的M0組STAT1蛋白大部分表達在胞漿中，LPS和IFN-γ刺激后的M1型巨噬細胞STAT1 大部分入核，而經(jīng)630 nm LED照射后STAT1入核減少（圖4）。結(jié)果表明，630 nm LED照射可抑制M1型巨噬細胞中STAT1向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。

圖4 630 nm LED照射抑制THP-1來源巨噬細胞的STAT1向核內(nèi)轉(zhuǎn)移Fig.4 630 nm LED irradiation inhibits the intranuclear transfer of STAT1 in THP-1-derived macrophages

3 討論

LED光療因為具有抗炎、鎮(zhèn)痛和愈合傷口的作用，在臨床實踐中被廣泛應用，將適當?shù)?LED光療法作為輔助手段與許多其他手術(shù)或非手術(shù)方法結(jié)合，可達到顯著的治療效果。有研究報道，945 nm LED可誘導IL-6和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）的基因下調(diào)，轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）和精氨酸酶-1（arginase-1，ARG1）的基因上調(diào)，表明巨噬細胞極化為M2表型有助于組織修復和炎癥消退［17］。另有研究報道，630 nm LED通過Nrf2和NF-κB信號通路抑制單核/巨噬細胞炎癥和降低細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。因此，LED對于調(diào)節(jié)巨噬細胞有重要作用。

在本研究中，我們檢測了630 nm LED對THP-1來源的M1型巨噬細胞活力的影響，結(jié)果表明，以40.02 mW/cm2的功率對THP-1來源的M1型巨噬細胞進行單次10 min（24 J/cm2）照射3次不影響其細胞活性。有報道指出，630 nm LED照射超過30.6 J/cm2后，THP-1細胞的存活能力下降［16］?？梢娺x擇正確波長、提供適當?shù)墓夤β拭芏群妥銐虻哪芰棵芏葘τ诰奘杉毎麡O化以及相關(guān)疾病的治療十分重要。

M1型巨噬細胞表達CD80、CD86等分子可通過分泌多種促炎癥因子（如IL-6、IL-23、IL-1β和TNF-α等）以及趨化因子（CXCL9、CXCL10、CXCL11）促進炎癥的發(fā)展，加速細胞外基質(zhì)降解和細胞凋亡，調(diào)節(jié)并促進 Th1 型免疫應答［18］。IRF5作為干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factor，IRF）家族的成員具有多種功能，包括激活編碼炎癥細胞因子、I型干擾素（interferon type I，IFN-I）和腫瘤抑制因子的基因，已被定義為 M1 巨噬細胞極化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［19］。在本研究中，我們檢測了M1型巨噬細胞的相關(guān)基因表達，發(fā)現(xiàn)經(jīng)630 nm LED照射后，IRF5、CXCL9、CXCL10、CXCL11mRNA的相對表達較M1對照組顯著降低。有研究報道，810 nm PBM 抑制了經(jīng)典活化巨噬細胞的標志物，減少了促炎細胞因子包括TNF-α和IL-1βmRNA的表達和分泌，除此之外，PBM可顯著降低經(jīng)典激活的骨髓來源的巨噬細胞（bone marrow-derived macrophages，BMDM）中NF-κB p65的表達和磷酸化，表明PBM可以成功調(diào)節(jié)經(jīng)典激活小鼠骨髓來源的巨噬細胞BMDM的炎癥和極化［20］。與之前的研究一致的是，我們的數(shù)據(jù)也證明了630 nm LED照射對于M1型巨噬細胞極化具有顯著的抑制作用。還有研究表明，780 nm和660 nm兩種激光都能夠減少TNF-α和誘導性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的基因的表達，但660 nm 激光會導致IL-6表達和產(chǎn)生的上調(diào)［21］，說明不同的光照參數(shù)對于細胞的調(diào)節(jié)效應不同。因此，選用正確的參數(shù)，如波長、功率密度、能量密度、照射頻率、操作制度和連續(xù)照射之間的間隔，是實現(xiàn)預期結(jié)果的基礎(chǔ)。

巨噬細胞極化受多種轉(zhuǎn)錄因子的影響，JAK激活的STAT蛋白家族成員是調(diào)控巨噬細胞 M1/M2 極化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［22］。通過刺激IFN-γ受體觸發(fā)JAK介導的酪氨酸磷酸化和STAT1二聚化，STAT1以同源二聚體的形式遷移到細胞核，與編碼iNOS、MHC II類反式激活因子（MHC class IItransactivator，CIITA）和IL-12等基因的啟動子中的順式元件γ激活序列結(jié)合，調(diào)節(jié)M1巨噬細胞的極化［23］。雖然LED療法在臨床上治療疾病中的應用顯著增多，但對光照射的作用機制，特別是紅光照射對預防和治療巨噬細胞極化相關(guān)疾病的作用機制研究較少。為了闡明其相關(guān)機制，我們研究了630 nm LED照射對于經(jīng)典巨噬細胞極化的轉(zhuǎn)錄因子STAT1的影響。與對照組相比，M1+LED組巨噬細胞中總STAT1的相對表達量沒有顯著變化，但核蛋白中STAT1經(jīng)照射處理后的相對表達量較M1組顯著降低。與免疫印跡結(jié)果一致的是，細胞免疫熒光結(jié)果顯示，630 nm照射處理后STAT1入核減少。抑制STAT1入核是調(diào)控巨噬細胞極化的重要因素。如TIM-3通過Y256和Y263殘基與JAK 競爭結(jié)合STAT1，可抑制 STAT1 磷酸化和核轉(zhuǎn)位，從而抑制巨噬細胞中的STAT1-miR-155信號軸，促進巨噬細胞極化為M2 表型［10］。新色胺S5通過降低促炎細胞因子、下調(diào)NF-κB和STAT1信號顯著抑制M1樣巨噬細胞的極化［24］。然而，巨噬細胞極化的機制復雜，630 nm LED調(diào)節(jié)巨噬細胞極化的其他分子機制還需進一步研究。本研究首次發(fā)現(xiàn)630 nm LED照射可通過抑制STAT1核轉(zhuǎn)位對M1型巨噬細胞極化產(chǎn)生抑制作用，這一發(fā)現(xiàn)可能對治療巨噬細胞極化相關(guān)疾病提供治療策略。