李燕雛，沈 蘭，王 丹，李 平*

（1.四川大學(xué)華西醫(yī)院頭頸腫瘤科，成都 610041；2.重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 402260）

拉曼光譜用于化學(xué)、物理學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等各領(lǐng)域，是物質(zhì)組份鑒定的重要研究手段［1］。生物組織中，約90%的拉曼峰分布在Δν~為500～1 800 cm-1的區(qū)域內(nèi)，10%分布在Δν~為2 700～3 300 cm-1的區(qū)域內(nèi)［2］。既往研究已證實，拉曼光譜對于診斷Barrett食管上皮類瘤變和乳腺癌具有較好的特異性和敏感性［3-5］。

臨床中，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）Ⅲ、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤屬于高級別膠質(zhì)瘤。患者預(yù)后差，術(shù)后須行腦部放療、全身化療或替莫唑胺等綜合治療。對于WHO Ⅲ級間變膠質(zhì)瘤，患者中位生存期為3～4年，而WHO Ⅳ級腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的中位生存期僅14.6～17.0個月。因此，相較于Ⅲ級腦膠質(zhì)瘤，Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤的惡性程度更高，患者總生存時間（overall survival，OS）更低。因此，準(zhǔn)確鑒別診斷Ⅲ、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤對判斷患者預(yù)后及指導(dǎo)治療具有重要意義。目前臨床應(yīng)用中，一方面，腦膠質(zhì)瘤分級主要依靠術(shù)中冰凍及術(shù)后石蠟病理診斷，通過鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的類型、細(xì)胞核分裂相、有無壞死組織、有無腫瘤血管生成和免疫組織化學(xué)綜合分析得出WHO腦膠質(zhì)瘤的分級［6］，但基于光鏡觀察及免疫組織化學(xué)檢查得出的腦膠質(zhì)瘤分級診斷存在缺陷；另一方面，Ⅲ和Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤術(shù)中快速冰凍切片診斷的準(zhǔn)確性和及時性是輔助判定手術(shù)切除范圍的重要參考指標(biāo)，繼而可直接影響患者的預(yù)后。因此，需要更加敏感而準(zhǔn)確的方法輔助確認(rèn)腦膠質(zhì)瘤的術(shù)中和術(shù)后分級。近年來，因拉曼光譜簡便快速的特點，用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷研究逐步受到重視［7-9］。既往研究顯示，利用拉曼光譜技術(shù)區(qū)分腦膠質(zhì)瘤組織與正常組織具有可行性［10-11］。Senada等［12］和Christoph等［13］的研究顯示，將膠質(zhì)瘤活組織與壞死組織的拉曼譜帶進(jìn)行聚類分析，并結(jié)合病理診斷將聚類的光譜歸類到活組織或者壞死組織這一分類模型的準(zhǔn)確率可達(dá)100%，但其研究沒有證明拉曼光譜能鑒別診斷Ⅲ和Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤。

本研究利用激光共聚焦拉曼光譜探討正常腦組織與Ⅲ、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤組織的差異，并探索Ⅲ、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤的拉曼光譜鑒別診斷方法。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備和標(biāo)本測量

本研究納入1例正常腦組織標(biāo)本（病灶切緣周圍正常組織）及13例Ⅲ、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本（表1）。新鮮腦組織樣本隨腦膠質(zhì)瘤手術(shù)取材于四川大學(xué)華西醫(yī)院神經(jīng)外科，未單獨再次取材。所有標(biāo)本離體后立即存入液氮，并于離體后48 h內(nèi)制作冰凍切片（德國，Leica CM 1 950）。切片前使用預(yù)冷生理鹽水清洗組織樣本3次，冰凍切片厚度為25 μm，切片平整。冰凍切片制作后2 h內(nèi)進(jìn)行拉曼光譜檢測。

表1 腦膠質(zhì)瘤入組樣本信息Tab.1 Information on the glioma samples

采用InVia顯微聚焦拉曼光譜儀（英國，Renishaw公司）進(jìn)行冰凍切片樣本檢測。在室溫、暗光環(huán)境下，采用514 nm激光光源進(jìn)行樣本掃描，設(shè)定曝光時間為15 min，光譜分辨率大于0.65 cm-1，掃描能量為20.2 mW，放大倍率為1 000倍。掃面范圍為400～4 000 cm-1的拉曼位移。樣本測量前預(yù)處理石英載玻片，在分析中去除載玻片本底光譜的影響［14-16］。

1.2 特征峰分析及統(tǒng)計學(xué)方法

使用Origin 8.0軟件（美國，OriginLab公司）進(jìn)行拉曼譜線的繪制和分析。采用人工尋峰及Peak Analysis插件在基線擬合后與自動尋峰相結(jié)合的方法找出典型的拉曼特征峰進(jìn)行比較。在人工尋峰及自動尋峰找出的拉曼特征性峰中對比正常腦組織、Ⅲ級腦膠質(zhì)瘤、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤組織的拉曼絕對峰位移、特征峰位移比值，并采用聚類分析等方法找出正常腦組織與腦膠質(zhì)瘤組織之間拉曼位移的差別，同時分析Ⅲ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤的特征峰及其代表的分子鍵的變化，利用特征峰的位移判斷腦膠質(zhì)瘤的級別。經(jīng)Origin分析后得出的特征峰數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0（美國，GraphPad Software公司）進(jìn)行統(tǒng)計分析，P值小于0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 拉曼峰進(jìn)行譜帶指認(rèn)

經(jīng)病理分級證實的Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤樣本有9例（樣本1～9），占總例數(shù)的69.2%；Ⅲ級腦膠質(zhì)瘤樣本有4例（樣本10～13），占總例數(shù)的30.8%。將所獲得原始拉曼譜線進(jìn)行平滑、去基線和識別拉曼峰及其峰位處理，并通過對比譜帶數(shù)據(jù)庫對拉曼峰進(jìn)行譜帶初步指認(rèn)（表2）。

表2 腦膠質(zhì)瘤冰凍切片拉曼譜帶歸屬表Tab.2 Classification of Raman bands in frozen sections of glioma

2.2 正常腦組織特征拉曼光譜

經(jīng)測量并結(jié)合數(shù)據(jù)庫資料發(fā)現(xiàn)，正常腦組織在1 064、1 297、1 437、1 664、2 852、2 883和2 932 cm-1峰位處表現(xiàn)出典型的膽固醇鍵和脂鍵，在1 005 cm-1峰位處表現(xiàn)為苯基丙氨酸。此外，正常腦組織I2932與I2852、I2883處拉曼峰值的比值分別為：I2932/I2852=0.92±0.10、I2932/I2883=0.95±0.15，說明2 852和2 883 cm-1處峰值相對2 932 cm-1處峰值明顯增高，這與腦膠質(zhì)瘤組織在I2930/I2850=1.58±0.26（P=0.04*）、I2930/I2898=1.25±0.10（P=0.02*）處拉曼峰值比值存在顯著差別（圖1）。相較正常腦組織中在1 664 cm-1表現(xiàn)出的單峰，Ⅲ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤中其對應(yīng)峰藍(lán)移至1 660 cm-1峰處。通過譜帶指認(rèn)得出，腫瘤組織中1 660 cm-1處蛋白質(zhì)鍵取代了正常腦組織中1 664 cm-1處的脂鍵（表3）。

表3 正常腦組織和Ⅲ、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤拉曼位移特征分析結(jié)果Tab.3 Characteristics of Raman shift in normal brain tissue and grade Ⅲ & Ⅳ glioma

圖1 正常腦組織與Ⅲ、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤組織的拉曼特征光譜Fig.1 Raman characteristic spectra of normal brain tissue and grade Ⅲ and Ⅳ glioma tissues

2.3 Ⅲ、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤特征性拉曼光譜

本研究發(fā)現(xiàn)，Ⅲ和Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤樣本的拉曼絕對峰位在565、717、1 001、1 103、1 205、1 340、1 394、1 440、2 725、2 850、2 872、2 898、2 930、3 011和3 060 cm-1等處相同，而在1 235、1 260、1 311、1 360、1 583、1 660、3 160和3 300 cm-1處出現(xiàn)有差異的拉曼特征峰（圖2）。

圖2 Ⅲ及Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤組織拉曼特征光譜對比及聚類分析結(jié)果Fig.2 Comparison of Raman characteristic spectra in grade Ⅲ and Ⅳ glioma tissues

分析峰位和峰強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，Ⅲ級腦膠質(zhì)瘤的樣本在1 311 cm-1的特征峰被1 360 cm-1處掩蓋，僅表現(xiàn)為次峰，其主峰移位到了1 235 cm-1處；而Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤樣本的在1 311 cm-1峰位處為主峰，并未被1 360 cm-1峰位處波峰掩蓋。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在1 583 cm-1和1 660 cm-1處出現(xiàn)的拉曼特征峰具備顯著的定性區(qū)分價值。進(jìn)一步通過對兩組樣本位于I1660/I1583、I1311/I1360和I1235/I1360等處的峰強(qiáng)度比值分析發(fā)現(xiàn)：在Ⅳ級及Ⅲ級腦膠質(zhì)瘤中，拉曼位移I1660/I1583的比值分別為1.26±0.20和0.98±0.20（P=0.03*）；拉曼位移I1311/I1360的比值分別為1.07±0.05和0.98±0.08（P=0.04*）；拉曼位移I1235/I1360比值分別為0.99±0.03和0.91±0.07（P=0.01*）。Ⅲ、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤特征拉曼位移比值的比較見表4。

表4 Ⅲ&Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤特征拉曼位移比值比較Tab.4 Comparison of Raman shift ratios between grade Ⅲ and Ⅳ glioma

本研究將13例腦膠質(zhì)瘤拉曼波譜樣本歸為兩類，并與WHO病理分級相對照，結(jié)果兩例樣本（樣本10與樣本12）的病理分級結(jié)果與拉曼檢測判別結(jié)果不一致。由此可得出，拉曼光譜判別Ⅲ、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤分期與病理分期的符合率為86%。進(jìn)一步分析兩例異質(zhì)性樣本，經(jīng)高年資病理科醫(yī)生共同討論后認(rèn)為：樣本10的病理應(yīng)診斷為Ⅲ級少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤，但其細(xì)胞核異型性、血管生成程度及組織壞死程度與Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織病理病變程度相當(dāng)；經(jīng)復(fù)核，樣本12含有Ⅲ級和Ⅳ級膠質(zhì)瘤的成分。因此兩例異質(zhì)性樣本病理復(fù)核結(jié)果支持Ⅳ級膠質(zhì)瘤的診斷。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤的分級與治療方法和預(yù)后密切相關(guān)。臨床中病理診斷為低級別膠質(zhì)瘤的患者的病變可呈現(xiàn)出高級別膠質(zhì)瘤生長、復(fù)發(fā)現(xiàn)象，這類患者更需要對其病理分級診斷進(jìn)行補充，進(jìn)一步提升診斷準(zhǔn)確性。拉曼光譜是一種用于檢測生物信息的分子光譜成像技術(shù)［17-18］。任何組織的病理改變均伴隨著細(xì)胞內(nèi)組分的分子結(jié)構(gòu)或量的改變，惡性腫瘤組織的顏色有別于正常組織，并且顏色的差別是由細(xì)胞中分子的電子能及躍遷強(qiáng)度所決定［19］。因此，組織標(biāo)本顏色差異的現(xiàn)象和電子躍遷的微觀理論可說明，在微觀層面研究病變組織是可行的，分子內(nèi)的細(xì)微改變將會體現(xiàn)在拉曼光譜譜帶變化之中。同時，拉曼光譜檢測具有無損傷性、高靈敏度、檢測迅速等特點，可通過分子譜帶找出組織分子結(jié)構(gòu)差別，是研究腫瘤診斷和判斷預(yù)后的良好方法之一［20-21］。既往研究中，Catherine等［3］及Galli等［22］不僅獲得了正常腦組織的特征拉曼譜帶，其研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜分析對原發(fā)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）的識別率可達(dá)94%，復(fù)發(fā)性GBM的識別率可達(dá)100%。臨床中需基于不同分級腦膠質(zhì)瘤類型制定不同的化療、靶向、放療及電場治療方案，因此腦膠質(zhì)瘤分級對臨床治療具有重要的指導(dǎo)意義。本研究不僅對正常腦組織與高級別腦膠質(zhì)瘤組織進(jìn)行了對比分析，更進(jìn)一步創(chuàng)新地對Ⅲ、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤間的特異性進(jìn)行了探討，闡述了Ⅲ、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤之間在拉曼光譜上的特異性及其對應(yīng)分子層面改變，并因其靈敏性更具備腦膠質(zhì)瘤快速診斷的潛力，可為腦膠質(zhì)瘤術(shù)中準(zhǔn)確診斷和確定切除邊界提供新的參考和指導(dǎo)，為降低腦膠質(zhì)瘤局部復(fù)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

既往研究表明，細(xì)胞內(nèi)核酸、脂類、蛋白質(zhì)、糖類等組分的差異會導(dǎo)致細(xì)胞拉曼特征位移的差異，故拉曼光譜可用于腫瘤良惡性的鑒別［23］。本研究中，Ⅲ級和Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞異型性程度不同，因此兩級腫瘤的惡性程度也不同，拉曼光譜檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)了不同級別腦膠質(zhì)瘤顯示不同的特征拉曼峰位分布。結(jié)果可見：測量細(xì)胞的拉曼特征峰位移差異反應(yīng)了兩級腦膠質(zhì)瘤的惡性程度的差異；正常組織與Ⅲ、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤組織在1 750～2 750 cm-1峰位之間有較大的差別，但Ⅲ級與Ⅳ級膠質(zhì)瘤樣本細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)Trp、蛋白質(zhì)Phe、脂類δ（CH2）成分種類無明顯變化。同時，無論Ⅲ級腦膠質(zhì)瘤樣本是否出現(xiàn)1 660 cm-1拉曼特征峰，其終究會在1 583 cm-1處出現(xiàn)較強(qiáng)峰值的拉曼特征峰，而Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤樣本均在1 660 cm-1峰位出現(xiàn)特征峰，但并未在1 583 cm-1峰位處表現(xiàn)出特征峰；再對Ⅲ、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤在1 583和1 660 cm-1處相對峰強(qiáng)度比較，結(jié)果可見，Ⅲ級與Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤在I1660/I1583、I1311/I1360峰位的比值具有顯著的差異?；谶@些研究結(jié)果，我們認(rèn)為，當(dāng)以比值“1”為I1660/I1583和I1311/I1360的界值時，I1660/I1583和I1311/I1360比值可用于區(qū)分Ⅲ級和IV級腦膠質(zhì)瘤，證明了1 235 cm-1峰位隨1 311 cm-1峰位的峰強(qiáng)度變化而變化，即說明1 360 cm-1僅影響1 235 cm-1和1 311 cm-1的絕對峰強(qiáng)度，而不影響其相對峰強(qiáng)度，可推測Ⅲ、Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)改變呈比例變化。

研究過程中出現(xiàn)了兩例病理分級結(jié)果與拉曼檢測結(jié)果不一致的爭議樣本，但經(jīng)病理復(fù)核后支持了拉曼光譜分析結(jié)果，體現(xiàn)出拉曼光譜診斷的敏感性及準(zhǔn)確性，也在一定程度上解釋了臨床工作中有些患者雖然病理診斷為低級別腦膠質(zhì)瘤，但治療后亦出現(xiàn)迅速局部復(fù)發(fā)等高級別腦膠質(zhì)瘤具備的生物學(xué)行為。因此，通過對兩例爭議樣本的分析可以初步認(rèn)為，拉曼光譜測得的分級結(jié)論不依賴于腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的類型，而是直接通過檢測細(xì)胞內(nèi)的組分物質(zhì)中電子變化實現(xiàn)的，其檢測結(jié)果可以直接反映腦腫瘤病變的異型性和組織壞死程度，為腦膠質(zhì)瘤的診斷和分級提供了更豐富的信息。

綜上，激光共聚焦拉曼光譜能輔助病理診斷，特別是對于取材少、細(xì)胞混合的病理組織，其能快速、準(zhǔn)確地判斷切除腫瘤包塊的邊界是否有腫瘤組織殘存，成為神經(jīng)外科術(shù)中鑒別殘余腫瘤的重要參考［24］，有助于優(yōu)化治療方案及輔助確定手術(shù)切除范圍，并最大限度保護(hù)正常腦組織。因此，激光共聚焦拉曼光譜是一種高效、準(zhǔn)確的對腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行診斷及分級的輔助手段，具備可期的臨床應(yīng)用前景。