李方一，李錦衛(wèi)，黃 璜，官 梅，2，官春云，2*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.農(nóng)學(xué)院；b.商學(xué)院，長沙 410128；2.國家油料作物改良中心湖南分中心，長沙 410128）

油菜葉面積作為衡量油菜光合作用大小的重要指標被廣泛觀測，其面積大往往被認為“源”充足，光合效率高，有利于油菜結(jié)實器官的形成與產(chǎn)量的增加［1］。油菜葉面積作為重要的株型指標和農(nóng)藝性狀，是油菜育種學(xué)家品種改良和評價的重要指標。因此對油菜葉面積的精準測量，特別在大田情況下實現(xiàn)多生育期的無損測量，對衡量油菜品種的光合效能、油菜表型組研究、油菜品種的改良等具有重要意義。

作物葉面積是指作物葉的功能器官被測量的單面葉片面積值。葉面積的測量根據(jù)測量標的的不同，主要分為單葉葉面積、單株葉面積、群體葉面積三個測量維度，其中單葉維度的測量是單株和群體維度測量的基礎(chǔ)［2］。目前單葉維度的葉面積測量相對比較成熟，可按測量是否借助其他標的物面積的換算測量得到，分為直接測量法和間接測量法［3］，也可按測量過程是否對作物組織結(jié)構(gòu)造成損害分為有損測量和無損測量。代表性的直接測量法有網(wǎng)格法、紙樣稱重法、葉面積儀法［4-5］、打孔稱重法、鮮重法等，間接測量法有系數(shù)回歸法（亦稱“直尺法”，葉長寬積，以下縮寫為L×W）、圖像處理法、三維空間技術(shù)等。其中圖像處理法隨著數(shù)碼相機、智能手機等的普及，因其成本低、精度較高、便攜、可作無損測量等特點，近年來成為比較熱門的研究。研究者們通過數(shù)碼相機、掃描儀、手機等獲取圖像，選擇不同算法對圖像進行預(yù)處理、圖像濾波去噪、圖像分割、參照標的物的選擇等，通過提取葉片圖像像素值與參照物像素值進行比值換算測量面積值［6-11］。Dogan等［12］采用Photoshop CS6圖像處理技術(shù)建立像素值、像素面積和葉面積的關(guān)系，測量了當?shù)仄咸哑贩N的真實葉面積，精度可達99.96%～100.00%。劉時城等［13］借鑒遙感影像的面向?qū)ο髨D像特征提取的思想，實現(xiàn)對葉面積圖像特征值的提取和換算。另外，利用三維空間技術(shù)測量葉面積近年來取得了重要進展。研究者們構(gòu)建植物三維模型［14］，或通過激光雷達［15］、手機［16］和Kinect傳感器［17-18］等設(shè)備，采用不同算法重建植物的三維點云，通過計算網(wǎng)格面積計算出葉面積。這種三維空間技術(shù)能在一定程度上解決不在同一平面內(nèi)的扭曲葉面的面積估測問題。以上方法大多采取有損方式進行，且處于實驗室階段，真正能在大田環(huán)境下開展無損測量的很少。

單株維度的作物葉面積的測量方法從大類劃分主要有單葉累加法、抽樣回歸法、單株圖像處理法等。單葉累加法是測量所有單葉葉面積后再進行累加得到其測量值。目前基于單葉累加法常用到的單葉測量方法主要有葉面積儀法、系數(shù)回歸法、打孔稱重法、鮮重法等。便攜式葉面積儀可在田間作無損測量，操作簡便，精度尚可，但造價較高，且不同設(shè)備對作物葉片測量時有規(guī)格限制，如LI-3000便攜式葉面積儀只能測量葉片寬度小于12 cm（不含12 cm，以下同）的單葉。系數(shù)回歸法亦可作無損測量，且操作簡單，一般只需測量葉片長、寬即可，但通過建立回歸模型進行預(yù)測的結(jié)果有一定的誤差。Cristofori等［19］通過對葉面積與葉長和葉寬的乘積作回歸分析，建立了幾種用于估計柿樹葉面積的模型，最準確的模型的決定系數(shù)R2=0.98。曹櫟等［20］運用系數(shù)回歸法分析發(fā)現(xiàn)，葉片的長寬積與實測葉面積的擬合度最高，最能反映實際葉面積的葉片參數(shù)。張新平等［21］所選的6種不同植物葉片面積與葉片長寬乘積的線性回歸方程決定系數(shù)均較高，可以此法間接求算葉片面積。打孔稱重法和鮮重法方法類似，只能作有損測量，通過打孔器或裁剪方式獲得已知面積的葉片質(zhì)量，通過采樣葉片的質(zhì)量與已知面積的葉片質(zhì)量的比值換算即可得到采樣大致面積。但這類方法一般僅適用于葉片質(zhì)地比較均勻的作物品種，對于像油菜這種葉片不平整且存在褶皺的作物品種在測量時存在較大誤差。以上單葉累加法因操作繁瑣、工作量大難以完成，一般只在少量文獻的試驗方法部分作簡單介紹，鮮有系統(tǒng)報道。

抽樣回歸法是不同生育期選擇單株不同部位單葉或多葉測量其面積，與單株葉面積作相關(guān)性分析，通過建立與單株葉面積相關(guān)性好的單葉或多葉回歸模型，預(yù)測單株葉面積。抽樣回歸法對于單葉或多葉的測量仍需采用以上單葉測量用到的方法，與單葉累加法不同的是，其不必對作物植株的每片葉進行測量。抽樣回歸法雖然更省工省時，但由于是間接測量，無法完全反映植株生長的真實情況，精確度相對較差。這種方法在測量樣本較多或測量精度要求不高的情況較為常用。

單株圖像處理法是通過對作物整株多角度拍攝獲取圖像，經(jīng)圖像處理與單株葉面積建立回歸模型預(yù)測單株葉面積。其中用于建模和檢驗的單株真實葉面積的測量方法仍需采用以上單葉測量用到的方法。該方法作為間接測量的方法，既可做到無損，又能實現(xiàn)較高效率的測量。蔣霓［22］綜合利用可見光成像、圖像處理及統(tǒng)計分析等技術(shù)，結(jié)合自動化測量平臺，構(gòu)建了實驗室環(huán)境下盆栽水稻單株綠葉面積的高通量無損測量，其建立的三個生育期水稻葉面積模型預(yù)測平均相對誤差分別為9.02%、10.52%、9.84%。該方法能大大提高作物單株維度葉面積的測量效率，且測量精確度在合適的范圍，筆者認為這也將是今后作物葉面積測量發(fā)展的趨勢。但該技術(shù)目前僅限水稻，相關(guān)平臺的籌建成本和對工作人員的要求都很高，對于油菜這種植株比較高大、枝葉比較復(fù)雜的作物，該類技術(shù)的應(yīng)用還有一定的難度。

與其他作物相比，油菜葉面積的測量具有較大難度。如甘藍型油菜一般具有長柄葉、短柄葉、無柄葉三種類型［23］，不同類型葉片面積差異較大，長柄葉面積可達600 cm2以上，短柄葉200～300 cm2左右，無柄葉大多不足100 cm2（圖1）。油菜葉片不平整，葉面有褶皺，且存在葉羽之間相互遮擋的現(xiàn)象。另外，油菜植株比較高大，通過盆栽等方式實現(xiàn)實驗室內(nèi)大規(guī)模培養(yǎng)的成本較高，且無法反映大田的真實情況，故一般采取田間試驗的方式培養(yǎng)，這給單株油菜葉面積的測量帶來較大的難度。

圖1 甘藍型油菜長柄葉(左)、短柄葉(中)、無柄葉(右)Fig.1 Long stalk (left), short stalk (middle) and sessile (right) of Brassica napus L.

目前油菜葉面積的測量主要處于單葉維度的測量，具體方法與以上介紹的其他作物單葉面積測量類似。單株維度的測量主要是基于單葉累加法常用的打孔稱重法、鮮重法、系數(shù)回歸法等。打孔稱重法、鮮重法采取有損方式進行，測量對采樣植株的葉片造成破壞，且精確度較差。抽樣回歸法測量精確度較差，單株圖像處理法測量條件和技術(shù)受限制，故均應(yīng)用較少。

本研究是依托國家油料中心湖南分中心平臺，作為理想株型育種研究的子項，目的是通過對油菜株型的考察，篩選有利于角果豐產(chǎn)的理想株型，其中單株維度的葉面積是重要指標之一。通過對以上各測量方法的不同特點進行分析和比較，結(jié)合本研究團隊已取得的工作基礎(chǔ)和條件，圍繞“無損、高精確度和高效率”的測量目標，本文提出了一套根據(jù)油菜不同的生育期葉片的特點，有針對性地選擇圖像處理法、葉面積儀法、系數(shù)回歸法（L×W）和紙樣稱重法四種方法綜合運用的單葉累加測量策略，最終實現(xiàn)單株維度下田間多生育期油菜葉面積無損、高精確度和高效率的測量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)備

1.1.1 材料

本試驗所選用的油菜單株樣本來自于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜試驗基地。試驗時間為2017年10月至2018年5月，品種為早熟品種420（winterBrassica napusL.A1，株型緊湊）、中熟品種1035（winterBrassica napusL.A2，株型標準）、雜交品種991（winterBrassica napusL.A3，株型高大），進行了3個肥力處理（總養(yǎng)分≥45%的復(fù)合肥，N、P2O5、K2O各含15%），即0.053 kg/m2（B1）、0.068 kg/m2（B2）、0.083 kg/m2（B3），3個重復(fù)處理，每個小區(qū)的種植面積為10.8 m2，密度為15株/m2，于2017年10月初播種，苗期進行間苗、移栽。不同品種、不同施肥水平旨在創(chuàng)建大小、形狀不同的單株樣本。分別于2017年12月24日、2018年3月11日、2018年3月31日3個生育期（苗期、初花期、盛花期）對每個小區(qū)的3～4株同一代表樣株持續(xù)進行單株維度的葉面積無損測量，共83株。本研究中油菜單株葉面積是指油菜植株所有葉片單面面積值，其中長柄葉、短柄葉面積含葉柄部分的面積。

1.1.2 主要設(shè)備和軟件

主要設(shè)備有多媒體電腦、Li-3000C便攜式葉面積儀、蘋果iphone 6手機、直徑為30 mm的黑色引磁片（工業(yè)級）、白色硬紙板、直尺等。

主要軟件有采用本課題組自行開發(fā)的“農(nóng)作物數(shù)字圖像分析系統(tǒng)”［24］（CMS2.0，以下簡稱“圖像系統(tǒng)”，計算機軟件著作權(quán)號：2011SR065145）、DPSV7.05版數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件、常用Adobe Photoshop、Office辦公軟件等。

1.2 測量方法和技術(shù)路線

由于需要考察同一株油菜多生育期葉面積的變化情況，故首先要做到無損測量，不對植株后期生長造成影響，在此前提下盡可能實現(xiàn)高精確度和高效率，最終確定了圖像處理法、葉面積儀法、系數(shù)回歸法（L×W）和紙樣稱重法四種方法的綜合運用。首先，建立前三種無損測量方法與紙樣稱重法的校正模型，分析比較三種方法精確度和測量效率。通過選取不同樣株、不同葉形的葉片若干片，其中一部分葉片分別用圖像處理法、葉面積儀法和系數(shù)回歸法（L×W）作無損測量，再用紙樣稱重法作有損測量，通過紙樣稱重法的測量結(jié)果與圖像處理法、葉面積儀法和系數(shù)回歸法（L×W）三種方法的測量結(jié)果進行相關(guān)性分析，建立三種方法的校正模型；再用另一部分葉片檢驗比較三種方法校正模型的精確度，同時比較三種方法的測量效率，以上過程簡稱為“校正試驗”。分別統(tǒng)計苗期、初花期、盛花期樣本葉片數(shù)量和分析葉形特點，根據(jù)“校正試驗”的結(jié)論確定運用三種測量方法的方案。實施葉面積測量，分析測量結(jié)果的合理性。本研究技術(shù)路線如圖2。

圖2 研究技術(shù)路線Fig.2 Research technical route

1.3 測量原理和操作

1.3.1 圖像處理法

圖像處理法是一種圖像處理技術(shù)與數(shù)據(jù)分析相結(jié)合的研究方法［25］?；驹硎峭ㄟ^專門設(shè)備按照相應(yīng)標準獲取含標準參照物的葉片圖像，標準參照物的面積已知，通過專門軟件提取葉片圖像像素和標準參照物像素，通過計算葉片圖像像素與已知面積標準參照物像素的比值，即可得到葉片面積值。本研究中獲取圖像的設(shè)備即筆者平時所用蘋果iphone 6手機。根據(jù)龔愛平等［26］研究的結(jié)論，當手機和葉片的拍攝距離在300～600 mm之間時，測量結(jié)果與葉面積儀測得的結(jié)果偏差最小，因此本試驗拍攝距離以此為標準。經(jīng)反復(fù)比較，選用標準參照物為直徑為30 mm的工業(yè)級黑色磨砂圓形引磁片，理由如下：一是引磁片主要用于固定、支撐手機，市面上容易獲得且成本低；二是黑色磨砂型可避免拍攝時反光，減少誤差；三是可通過背景硬紙板背面貼磁鐵的方式調(diào)節(jié)引磁片位置，有利于與葉片形成最佳參照位置。作為參照物的引磁片一般使用2個，在背景硬紙板上呈對角線放置，可以減少可能因拍攝角度和距離的不同造成的誤差。背景硬紙板選擇白色有利于后期葉片、引磁片的圖像分割。田間拍攝由兩人配合，一人負責(zé)擺放葉片、標準參照物和背景紙板的位置，要求葉片盡量貼合背景紙板，與背景紙板保持同一平面；一人負責(zé)拍攝，手機盡量垂直硬紙板進行拍攝，要求畫面清晰，避免反光、陰影和其他物遮擋，具體操作見圖3。

圖3 圖像處理法田間拍攝Fig.3 Image processing method field shooting

提取像素和計算葉面積的專門軟件是本課題組基于MatlabR2012a自行開發(fā)的“圖像系統(tǒng)”。具體步驟如下：

1）參照物的選定。對參照物的選定是圖像處理法精準測量的關(guān)鍵，通過圖像系統(tǒng)的“自動處理”功能可自動分離出作為參照物的引磁片。通過人工選擇的方式從2個引磁片中選定1個作為參照物并輸入?yún)⒄瘴锏拇笮?，原則上選擇與葉片位置更靠近、角度更相近的作為最終確定的參照物。如果2個引磁片作為參照物可能都存在一定誤差，可以分別選擇不同的引磁片進行測量，取其平均值。

2）圖像預(yù)處理算法的選擇。圖像的預(yù)處理包括圖像的變換、去噪等，主要目的是便于后期圖像的分割。通過對比，灰度變換和超綠變換可選作圖像變換，中值濾波可選作去噪。

3）圖像分割［27］。根據(jù)分割操作策略的不同可以分為基于閾值的分割、基于邊緣檢測的分割、基于區(qū)域的分割等。本次獲得的圖像是白色背景，葉片的綠色和白色在灰度上差異明顯，故采用基于灰度的閾值法進行分割，通過反復(fù)對比發(fā)現(xiàn)，采用Otsu法閾值分割和最大類間類內(nèi)距離比法的效果最好。如Nobuyuki Otsu給出的類間方差（intra-class variance，ICV）定義為：

圖像灰度值的均值為M，任取一個灰度值t，則可將這個直方圖分成前景色A和背景色B，這兩部分各自的平均值為MA和MB，A、B部分的像素數(shù)占總像素數(shù)的比例分別記作PA和PB。這個最佳的閾值t就是使得ICV最大的那個值。

4）填充、去雜質(zhì)等處理。由于葉片表面紋理、顏色深淺的差異且存在異物，以及背景可能存在的污垢、手指等，經(jīng)過圖像分割后的葉片圖像會出現(xiàn)孔洞和雜質(zhì)圖像，會導(dǎo)致面積計算出現(xiàn)一定的誤差。為減少以上誤差，一般需經(jīng)過“填充”“去雜質(zhì)”“清除邊界對象”“清除邊界附近對象”“腐蝕”“膨脹”等操作去除干擾因素。圖像處理過程如圖4。

圖4 圖像處理過程Fig.4 Image processing process

5）葉面積計算。經(jīng)過圖像處理后，原來的葉片圖像轉(zhuǎn)換為一幅葉片為白色、背景為黑色的二值圖像，利用Matlab中bwarea［28］函數(shù)統(tǒng)計像素值為1的所有像素的總數(shù)，即葉片部分的像素值，也稱像素面積，然后通過與已知面積參照物像素值之間的比值關(guān)系即可得該葉片葉面積。

S表示面積，Pix表示感興趣區(qū)域像素數(shù)。

6）葉面積校正。由于葉片測量時可能出現(xiàn)葉片卷曲難以完全鋪平或葉羽之間相互遮擋等情況，通過圖像處理法測量得到的葉面積值理論上要小于葉片的真實葉面積值。因此，對圖像處理法測量得到的葉面積值進行校正是十分必要的。故每一個生育期測量時，需單獨選取同一批次不同樣本，不同大小、形狀的葉片若干片，經(jīng)圖像采樣后，采取紙樣稱重法測量真實葉面積，通過對圖像處理法測量值與紙樣稱重法測量值作相關(guān)性分析和建立校正模型，對其他圖像采樣的葉片面積進行校正。

1.3.2 葉面積儀法

本試驗采用LI-3000C便攜式葉面積測量儀測量相關(guān)葉片。它使用了128個低頻紅光LED燈排成一排，每個LED燈位于每1 mm的正中央，共計128 mm，用來檢測葉片寬度，因此該儀器僅限對葉寬在12 cm內(nèi)的葉片測量。這些LED燈位于掃描頭上半部分距邊緣0.62 cm處，在測量過程中，將逐一點亮來計算這一排的方格數(shù)目。LI-3000C掃描頭的下半部分有一個透鏡式光敏二極管檢測系統(tǒng)（圖5），只對校準過的LED光脈沖有響應(yīng)。在這一排的所有方格被掃描結(jié)束后，通過拉動編碼輪拉繩（length encoding cord）繼續(xù)進行下一排的掃描。拉繩每被拉動1 mm，便啟動一次新的掃描來逐一點亮128個LED燈。由于拉繩每移動1 mm等于1 mm的長度，所以拉繩的運動方向必須垂直于128個LED燈構(gòu)成的直線。在每次掃描中，每一個被樣品遮擋50%以上的LED燈在總面積中累積1 mm2。例如，測量一個20 mm×100 mm的樣品，共進行100次掃描，每一次掃描有20個LED燈被遮擋，那么得出總面積為20 cm2。

圖5 LI-3000C掃描儀、掃描頭結(jié)構(gòu)和田間測量Fig.5 LI-3000C scanner, scanning head structure and field measurement

由于葉片測量時可能出現(xiàn)圖像處理法測量時出現(xiàn)的情形，故亦需要對測量葉面值作校正，方法與以上圖像處理法的葉面積校正方法相同。

1.3.3 系數(shù)回歸法（L×W）

利用油菜葉片長度和寬度之積與葉面積值有很強相關(guān)性的特征，通過建立部分樣本葉長寬積值與真實葉面積值的回歸模型，對其他樣本葉片面積進行估算。只需一人用直尺測量葉片最長、最寬的距離，獲得相關(guān)數(shù)據(jù)后進行數(shù)據(jù)處理。

1.3.4 紙樣稱重法

紙樣稱重法是一種基于物理原理的測量方法，利用標準紙面積與質(zhì)量成正比的特性進行換算得到葉面積值。首先，可通過高精度電子稱稱標準紙的質(zhì)量，用直尺測量標準紙的面積，面積除以質(zhì)量即可得單位質(zhì)量紙的面積。然后，在標準紙張上完全臨摹葉片形狀，裁剪得到相應(yīng)的標準紙，稱得紙的質(zhì)量再乘以單位質(zhì)量紙的面積即可獲得葉片的面積。對于大的葉片以及出現(xiàn)褶皺難以平攤的葉片可以剪成若干小塊，避免葉羽遮擋造成誤差。這種方法因完全臨摹真葉大小，精確度很高，通常用于其他測量方法作校正用，其測量值作為真實葉面積值。

2 結(jié)果與分析

2.1 測量精確度的結(jié)果分析

考慮到不同生育期油菜葉片可能存在差異，為科學(xué)制訂測量方案，在3個不同生育期進行葉面積測量前，均選取部分樣本進行“校正試驗”，并在不同生育期測量時采取相應(yīng)生育期的校正模型進行測量結(jié)果的校正。每次“校正試驗”均從3個品種和3個肥力處理的9個不同組合小區(qū)中隨機選取3株油菜，對每株油菜上、中、下部3個不同部位的葉片（共計81片）分別采用以上4種測量方法進行測量，對其中每個小區(qū)隨機選取的2株油菜3個部位的葉片（共54片）作相關(guān)性分析和建立校正模型；對每個小區(qū)的另一株油菜3個部位的葉片（共27片）進行精度檢驗。為了簡化論證過程，以下分析具體結(jié)果采用3個不同生育期“校正試驗”相應(yīng)結(jié)果的平均值來表示。

2.1.1 圖像處理法和紙樣稱重法的比較

對圖像處理法和紙樣稱重法的測量結(jié)果作相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r為0.96**，達到極顯著，校正前圖像處理法測量葉面積平均值為紙樣稱重法葉面積平均值的0.79。建立的一元回歸校正模型決定系數(shù)R2為0.91**，葉面積校正值相對紙樣稱重法測量值誤差為2.94%。同時選取了部分樣本進行了45°、60°、90°3個不同角度拍攝作圖像處理法測量，不同角度拍攝測量結(jié)果作一個區(qū)組進行差異性分析，測量結(jié)果差異不顯著，如表1所示。說明在大田情況下進行無損拍攝，對于因人拍攝角度差異造成的誤差不明顯，可以忽略，這與肖強等［29］、崔世鋼等［30］的研究結(jié)果相似。

表1 不同角度拍攝的葉面積值的差異性分析Tab.1 Difference analysis of leaf area values photographed from different angles

2.1.2 葉面積儀法和紙樣稱重法的比較

對葉面積儀法和紙樣稱重法的測量結(jié)果作相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r為0.93**，達到極顯著，校正前葉面積儀法測量葉面積平均值為紙樣稱重法葉面積平均值的0.71。建立的一元回歸校正模型決定系數(shù)R2為0.86**，葉面積校正值相對紙樣稱重法測量值誤差為4.47%。

2.1.3 系數(shù)回歸法（L×W）和紙樣稱重法的比較

對葉長寬積值和紙樣稱重法測量結(jié)果作相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r為0.99**，達到極顯著，校正前系數(shù)回歸法（L×W）測量葉面積平均值為紙樣稱重法葉面積平均值的1.46。建立的一元回歸校正模型決定系數(shù)R2為0.99**，葉面積校正值相對紙樣稱重法測量值誤差為6.01%。

通過以上“校正試驗”結(jié)果分析可知，以上三種無損測量的方法均可實現(xiàn)油菜葉面積的精確測量。相對而言，圖像處理法精確度最高，葉面積儀法次之，系數(shù)回歸法（L×W）最低。對于圖像處理法和葉面積儀法校正前測量值偏小這一結(jié)果與之前的設(shè)想一致。不同生育期三種方法的“校正試驗”結(jié)論基本一致，但測量結(jié)果的具體相關(guān)系數(shù)和校正模型的回歸方程有所不同，以圖像處理法為例，三個生育期建立的一元回歸校正模型如圖6所示。這說明不同生育期油菜葉片存在一定的差異，通過不同生育期建立相應(yīng)校正模型有利于更精確的測量。

圖6 不同生育期圖像處理法與紙樣稱重法建立的校正模型Fig.6 Calibration model established by image processing method and paper weighing method at different growth stages

2.2 測量效率的結(jié)果分析

校正試驗過程中隨機選擇5株樣本進行測量效率測試，共計90片葉。分別用圖像處理法、葉面積儀法和系數(shù)回歸法（L×W）作無損測量，每種方法均由相同的兩人進行操作，期間用秒表進行計時。其中圖像處理法田間拍攝平均每株油菜的時間為198 s（不含前期編號等準備工作時間，以下方法相同），后期圖像處理平均每株油菜所用的時間為1 180 s，平均每株油菜的測量時間共計為1 378 s（約23 min）。葉面積儀法田間測量平均每株油菜的時間為90 s，系數(shù)回歸法（L×W）田間測量平均每株油菜的時間為126 s。考慮這兩種方法后期數(shù)據(jù)處理均不需針對每片葉進行，可作批量處理，故不計后期數(shù)據(jù)處理時間，田間測量時間即測量總時間。通過以上“效率測試”結(jié)果分析可知，葉面積儀法測量效率最高，系數(shù)回歸法（L×W）次之，圖像處理法最低，但在人力可接受范疇內(nèi)。

2.3 不同生育期測量方案的確定

根據(jù)以上精確度、測量效率分析的結(jié)論，結(jié)合苗期、初花期、盛花期樣本葉片數(shù)量和葉形特點，本試驗制定了不同生育期不同的測量方案。油菜苗期整體葉片數(shù)量不多，且以葉寬大于12 cm（含12 cm，以下同）的長柄葉為主，在人工強度能接受的前提下，主要通過圖像處理法進行測量，系數(shù)回歸法（L×W）對圖像處理法測量結(jié)果進行對比分析，通過紙樣稱重法建立的校正模型進行校正。初花期、盛花期葉片數(shù)量陡增，如果再以圖像處理法進行測量費工費時，難以完成?？紤]這兩個生育期內(nèi)葉片主要是葉寬小于12 cm的短柄葉、無柄葉增加較多，且長柄葉逐漸脫落數(shù)量減少，故這兩個生育期主要通過葉面積儀法測量葉寬小于12 cm的短柄葉、無柄葉，圖像處理法測量葉寬大于12 cm的長柄葉，系數(shù)回歸法（L×W）可用于少數(shù)殘缺或漏測葉片的測量及對其他方法進行比對分析，通過紙樣稱重法校正模型進行校正。

2.4 不同生育期葉面積無損測量的結(jié)果分析

2.4.1 苗期葉面積

83株樣本共計綠葉數(shù)769片，其中葉寬大于12 cm的長柄葉536片，占比70%。將其全部通過圖像處理法進行測量，得到總?cè)~面積為214 422 cm2，平均每株葉面積為2 583 cm2。其中A1、A2、A3平均每株葉面積分別為2 344、2 435、2 963 cm2，B1、B2、B3平均每株葉面積分別為2 183、2 624、3 003 cm2。另通過系數(shù)回歸法（L×W）測量所有葉片，得到總?cè)~面積為205 038 cm2，平均每株葉面積為2 470 cm2。其與圖像處理法測量結(jié)果比較，總體相對誤差為4.38%，不同品種、不同肥力處理樣本測量相對誤差在0.38%～9.54%之間，兩種測量方法結(jié)果接近。對不同品種、不同肥力處理樣本葉面積測量結(jié)果作差異性分析，測量結(jié)果在5%顯著水平上差異比較顯著，符合試驗設(shè)計的預(yù)期。這也與馬驛等［31］在油菜六葉期和蕾薹期不同氮肥水平下測量的葉面積差異水平結(jié)果相似。

2.4.2 初花期葉面積

83株樣本共計綠葉數(shù)1 686片，相比苗期呈倍數(shù)增加。其中葉寬小于12 cm的短柄葉和無柄葉1 145片，占比68%，通過葉面積儀法測量，得到葉面積為104 609 cm2；葉寬大于12 cm的長柄葉541片，占比32%，通過取圖像處理法測量，得到葉面積為206 889 cm2；總?cè)~面積為311 498 cm2，平均每株葉面積為3 753 cm2。其中A1、A2、A3平均每株葉面積分別為2 592、3 880、4 745 cm2，B1、B2、B3平均每株葉面積分別為3 250、3 531、4 563 cm2。另通過系數(shù)回歸法（L×W）測量所有葉片，得到總?cè)~面積為288 623 cm2，平均每株葉面積為3 477 cm2。與以上兩種方法測量結(jié)果進行比較，總體相對誤差為7.34%，不同品種、不同肥力處理樣本測量相對誤差在4.94%～12.13%之間。對不同品種、不同肥力處理樣本葉面積測量結(jié)果作差異性分析可知，測量結(jié)果在5%顯著水平上差異比較顯著，符合試驗設(shè)計的預(yù)期。

表2 苗期油菜樣本葉面積的測量結(jié)果Tab.2 Leaf area measurement results of rape samples at seedling stage

表3 初花期油菜樣本葉面積的測量結(jié)果Tab.3 Leaf area measurement results of rape samples at initial flowering stage

2.4.3 盛花期葉面積

83株樣本共計綠葉數(shù)2 055片，相比初花期又有大幅增加。其中葉寬小于12 cm的短柄葉、無柄葉1 685片，占比82%，通過葉面積儀法測量，得到葉面積為136 911 cm2；葉寬大于12 cm的長柄葉194片，占比9.4%，通過取圖像處理法測量，得到葉面積為69 090 cm2；另因葉片數(shù)太多且作無損測量，小部分葉片出現(xiàn)漏測的情況，共176片，占比8.6%，用系數(shù)回歸法（L×W）測量結(jié)果替代，葉面積為15 674 cm2；總?cè)~面積為221 675 cm2，平均每株葉面積為2 671 cm2。其中A1、A2、A3平均每株葉面積分別為1 598、2 717、3 659 cm2，B1、B2、B3平均每株葉面積分別為1 979、2 677、3 463 cm2。另通過系數(shù)回歸法（L×W）測量所有葉片，總?cè)~面積204 354 cm2，平均每株葉面積2 462 cm2。與以上三種方法測量結(jié)果進行比較，總體相對誤差為7.81%，不同品種、不同肥力處理樣本測量相對誤差在2.95%～10.91%之間。對不同品種、不同肥力處理樣本圖像處理法測量結(jié)果作差異性分析可知，測量結(jié)果均在1%顯著水平上差異比較顯著，符合試驗設(shè)計的預(yù)期。

3 討論

3.1 測量目標的定位

在大田情況下對單株維度的油菜葉面積進行多生育期無損測量是一項難度很大的工作。之所以難，其主要在于：一是要求進行無損測量，測量過程不得對樣本造成破壞，測量過程只能在田間進行。這大大縮小了我們能用到的測量方法范圍，測量操作難度加大，且難以實現(xiàn)“高通量”的目標。二是油菜葉片具有不規(guī)則性，無法用簡單的計算公式和模型進行精確估算。如系數(shù)回歸法（L×W）是一種相對比較簡單、高效的方法，之所有沒有優(yōu)先選擇，在于該方法的測量準確度相比其他方法要差些，對于精確度要求較高的試驗而言，難以滿足要求，但其仍具有輔助測量和對其他方法進行參考的價值。三是油菜葉片數(shù)量多，測量任務(wù)重，使我們在考慮測量精確度的同時，不得不考慮效率。因此，我們提出油菜單株葉面積的測量需要實現(xiàn)“無損、高精確度和高效率”三大目標。首先是實現(xiàn)無損測量，這是由本次研究的目標決定的，需要對同一株油菜多個生育期的葉面積進行測量，每次測量不對油菜后期的生長造成影響。高精確度測量是個相對的概念，當前對單株和群體的葉面積測量只能盡可能減少影響測量精確度的因素，而不能完全準確地進行測量［2］，是相對較高精確度的范疇。高效率是因為油菜單葉比較多，單株維度油菜葉面積測量任務(wù)比較重，故首先要確保能夠在有限的人力、物力投入的前提下按時完成測量任務(wù)。

表4 盛花期油菜樣本葉面積測量結(jié)果Tab.4 Leaf area measurement results of rape samples at full-blooming stage

3.2 高精確度和高效率之間的取舍

單株維度的作物葉面積的測量在大的方向上是選擇單葉累加這種直接測量的方法，還是通過抽樣回歸或其他估算的間接測量的方法值得商榷。直接測量的方法是對單株所有葉進行測量累加得到的結(jié)果，相對最能反映真實情況。間接測量的方法是選取有代表性的或與單株葉面積相關(guān)性好的葉片面積作單株葉面積的估算。估算往往會忽略影響葉面積測量結(jié)果的諸多復(fù)雜因素，如葉片的形狀、葉片質(zhì)地、單株葉片數(shù)量、密度的不均勻、枝葉的相互遮擋等，其結(jié)果將葉面積測量的精確度稀釋成無法評價其準確性的近似結(jié)果。如兩株截然不同的單株樣本可能因抽樣的少量葉片面積大致相當導(dǎo)致估算的結(jié)果相似；或兩株大體相近的單株樣本可能因抽樣的少量葉面積相差很大導(dǎo)致估算的結(jié)果大相徑庭。基于群體維度葉面積的間接測量更是如此，如通過葉面積指數(shù)儀等測量的結(jié)果意義更多地體現(xiàn)在大致情況或變化特征，其準確性難以評價。劉镕源等［32］、Bréda等［33］均報道反映了通過間接方法測量的葉面積指數(shù)值不能區(qū)分葉片和枝干等其他器官遮擋的影響等，測量結(jié)果與其他直接測量法測量結(jié)果相差很大。本研究要求掌握油菜單株葉面積的真實情況，反映的是多葉的聚合效應(yīng)，測量方法的不當容易造成測量結(jié)果出現(xiàn)較大的誤差。單葉累加法具有抽樣回歸法等不可比擬的測量精度，符合本研究高精確度的測量要求，故作為本研究測量的基本方法。在大的方向上確定后，具體采用哪種方法實現(xiàn)單葉累加測量，則需重點考慮如何實現(xiàn)高效率的測量，這是我們完成測量任務(wù)的必要條件。

3.3 測量方法的選擇

基于以上分析，單株維度的油菜葉面積的無損測量前提是做到無損，大方向上應(yīng)以高精確度優(yōu)先，大方向確定后具體測量方法選擇上應(yīng)以高效率為主，并兼顧高精確度。從無損測量角度考慮，圖像處理法、葉面積儀法和系數(shù)回歸法（L×W）均可作無損測量，對于大于12 cm的單葉葉面積測量可選擇圖像處理法和系數(shù)回歸法（L×W）。從高精確度角度考慮，紙樣稱重法相對精確度高，但操作繁瑣、效率低，且只能作有損測量，一般用于其他方法校正時運用。葉面積儀法雖可直接讀取測量結(jié)果，但由于油菜葉片不平整且葉羽間存在遮擋，測量結(jié)果須作進一步校正。研究者通過對包括圖像處理法、系數(shù)回歸法（L×W）在內(nèi)的多種葉面積測量方法進行比較，認為圖像處理法精度較高［25，34-36］，本研究的結(jié)論也與之相一致。因此這兩種方法從精度上考慮優(yōu)先使用圖像處理法。另外，基于單葉累加法測量單株維度油菜葉面積，因其葉片數(shù)多，特別在盛花期時單株油菜平均葉片數(shù)大于30片，且考慮是無損測量，在測量時可能出現(xiàn)葉片漏測的情況（采樣過程中的確發(fā)生），因此對單株油菜每片葉測量葉長、葉寬，采取系數(shù)回歸法（L×W）作漏測葉片的補充或其他方法的對比分析十分必要。從高效率的角度考慮，葉面積儀法操作最為方便，可直接讀取葉面積值，效率最高，其他測量方法均須通過后期處理和計算才能得出結(jié)果，但該方法對被測葉片葉寬有限制，可優(yōu)先作為葉片寬度小于12 cm的單葉葉面積測量的方法。以盛花期葉面積測量為例，如均用圖像處理法測量，需增加耗時至少34 h。通過綜合運用不同的測量方法，可克服單一方法的局限和不足，發(fā)揮其最大化優(yōu)勢，在當前測量技術(shù)水平和條件下不失為較佳選擇。

3.4 同一種測量方法不同生育期校正模型的使用

根據(jù)以上“校正試驗”分析，同一種測量方法在不同生育期建立的校正模型和相關(guān)系數(shù)有所不同。經(jīng)對比，三種方法在三個生育期建立的一元線性回歸校正模型的斜率均呈增大狀態(tài)，如圖像處理法三個生育期校正模型的斜率分別為1.06、1.27、1.36，系數(shù)回歸法（L×W）三個生育期校正模型的斜率分別為0.55、0.57、0.59，說明三個生育期校正采樣的葉片面積分化程度在擴大。導(dǎo)致分化擴大的原因主要有兩個方面：一方面，三個生育期葉數(shù)呈較大幅度的增長，如苗期有769片，初花期有1 686片，盛花期有2 055片，而校正采樣葉片的數(shù)量卻沒變，其校正采樣占總體樣本的比例變小，自然分化的可能性變大；另一方面，三個生育期不同類型葉片的比例發(fā)生較大變化，如苗期葉寬大于12 cm的長柄葉有536片，占比70%，初花期葉寬大于12 cm的長柄葉有541片，占比32%，盛花期葉寬大于12 cm的長柄葉只有194片，僅占比9.4%，這也意味著在形態(tài)和面積上存在更大差異的短柄葉和無柄葉的比例在不斷增加，從而導(dǎo)致校正采樣葉面積分化加大。由此可知，不同品種和不同生育期的油菜葉片無論是數(shù)量還是形態(tài)均存在較大差異，為提高測量精確度，即使是同一測量方法，在測量前也應(yīng)針對不同品種和不同生育期建立相應(yīng)的校正模型，正所謂“一測量一系數(shù)”。

3.5 單株維度無損測量具體方法的改進

盡管本研究取得了階段性的進展，但仍存在諸多問題需作進一步改善。一是圖像處理法測量應(yīng)建立更可控的田間拍攝標準。盡管田間葉片拍攝前制訂了相應(yīng)的拍攝標準，開展了相應(yīng)的培訓(xùn)，但在多達近2 000多張葉片圖像處理過程中，圖像中不乏出現(xiàn)手指、田間雜物等干擾因素，有的葉片不能完全貼合紙面，有的標物擺放的位置不佳，有的白色硬紙板在拍攝特大葉片時不能完全襯托，有的因光線原因?qū)е滦纬闪艘欢ǖ年幱暗?，這些因素都對測量的精度造成了一定的影響。下一步需建立更具可操作性的相關(guān)標準，加強測量人員的培訓(xùn)和規(guī)范，及時排查不符合要求的圖像，提高拍攝圖像的質(zhì)量。二是“農(nóng)作物數(shù)字圖像分析系統(tǒng)”（CMS2.0）需進一步升級，朝“高通量”的目標努力。相對來說，圖像處理法誤差較小，但后期的圖像處理工作量較大，耗時較長。如本次試驗處理了近2 000張葉片圖像，按效率測試的結(jié)果處理1張圖像平均需66 s，大約需要36 h左右。下一步將在實現(xiàn)田間拍攝標準化的前提下，開發(fā)出具有批量處理的功能，提高圖像處理效率。三是為了進一步提高油菜葉面積無損測量的精度和效率，可根據(jù)不同的葉型（如短柄葉、無柄葉）進行分類處理和校正等。

本研究對單株維度油菜葉面積田間無損測量方法和策略進行了理論探析，并開展了相應(yīng)的實證研究。確立了“無損、高精確度和高效率”三大測量目標，確定了綜合運用圖像處理法、葉面積儀法、系數(shù)回歸法（L×W）和紙樣稱重法四種方法的單葉累加測量策略。通過測量精確度分析，圖像處理法、葉面積儀法、系數(shù)回歸法（L×W）均可實現(xiàn)油菜葉面積的精確測量，其中圖像處理法的測量精確度最高，葉面積儀法次之，系數(shù)回歸法（L×W）最低，測量誤差分別為2.94%、4.47%、6.01%。圖像處理法測量葉面積，對于因拍攝角度差異造成的測量誤差不明顯。同一方法通過不同生育期建立相應(yīng)校正模型有利于更精確的測量。從測量效率來看，葉面積儀法的測量效率最高，系數(shù)回歸法（L×W）次之，圖像處理法最低，但在人力可接受范疇內(nèi)。結(jié)合不同生育期葉數(shù)和葉形特點，并科學(xué)處理“高精確度”和“高效率”之間的關(guān)系，本試驗制訂了不同生育期葉寬大于12 cm的長柄葉主要通過圖像處理法進行測量, 葉片葉寬小于12 cm的短柄葉、無柄葉主要以葉面積儀法測量，所有葉通過系數(shù)回歸法（L×W）測量，用于少數(shù)殘缺或漏測葉片的補充，以及對其他方法測量結(jié)果作對比分析，通過紙樣稱重法校正模型進行校正的測量方案。測量結(jié)果符合試驗預(yù)期，基本實現(xiàn)“三大目標”。