倪紅 鄭卜真 王恩 柯紹發(fā) 王皖芬 馬傳花 羅莎

癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病。臨床上30%～40%的癲癇患者存在認知功能障礙，這對其生活、工作等均有較大的影響。此外，臨床常用的傳統(tǒng)抗癲癇藥物雖然能有效控制70%～80%的癲癇發(fā)作，但會加劇患者認知功能減退。N-甲基D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性氨基酸受體，其過度激活可導致癲癇，而癲癇發(fā)作后又可引起細胞膜內(nèi)外離子失衡，激活神經(jīng)毒性信號傳導途徑，產(chǎn)生神經(jīng)毒性效應，導致神經(jīng)元損傷或死亡，從而造成一系列神經(jīng)元功能障礙。NMDA受體的適當激活與學習、記憶、認知過程的形成有關(guān)。Stafstrom等[1]利用致癇模型研究發(fā)現(xiàn)NMDA受體過度興奮導致的發(fā)育期大鼠反復癲癇發(fā)作后，其成年期認知功能存在損傷，遠期神經(jīng)興奮性發(fā)生改變。Thompson等[2]研究發(fā)現(xiàn)，NMDA受體激活后繼發(fā)的內(nèi)向電流系Pannx1通道開放所致，阻斷Pannx1通道能抑制癲癇發(fā)作。甲氟喹是一種Pannx1通道阻滯劑，目前主要用于瘧疾的治療。Pinheiro等[3]研究發(fā)現(xiàn)，甲氟喹可抑制KA小鼠癲癇自發(fā)發(fā)作的頻率和總時間。因此，本研究就甲氟喹對急性癲癇小鼠認知功能的影響作一探討。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康黃色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因C57 Thy1-YFP小鼠30只，由蚌埠醫(yī)學院實驗動物中心提供。其中雄性16只，雌性14只；出生后15～17 d；體重（15.0±0.5）g。本實驗通過動物倫理委員會倫理審查，全程遵守實驗中心動物管理條例。

1.2 動物分組與處理 按隨機數(shù)字表法分為癲癇組、甲氟喹組和對照組，每組10只。甲氟喹組在建模前1 h按20ml/kg的劑量腹腔注射甲氟喹注射液（規(guī)格：25mg/片，批號：53230-10-7，深圳海思安生物技術(shù)有限公司；將25 mg甲氟喹溶于25 ml 0.9%氯化鈉溶液中配成1 g/L的甲氟喹注射液）[4]；癲癇組、對照組按20 ml/kg的劑量腹腔注射0.9%氯化鈉注射液。建模：癲癇組、甲氟喹組小鼠按3 ml/kg的劑量腹腔注射東莨菪堿注射液（規(guī)格：1 g/ml，批號：YRD059，成都儀睿生物科技有限公司；將2 mg東莨菪堿溶于10 ml的0.01 mol PBS中配成 0.2 g/L的東莨菪堿注射液），30 min后按15 ml/kg的劑量腹腔注射匹魯卡品注射液（規(guī)格：5 g/瓶，批號：CAS 54-71-7，北京Med Chem Express生物科技公司；將0.57 g匹魯卡品溶于20 ml 0.9%氯化鈉溶液中配成28.5 g/L的匹魯卡品注射液），誘發(fā)Ⅴ級癲癇發(fā)作持續(xù)1 h為建模成功。若注射后未誘發(fā)Ⅲ級以上癲癇發(fā)作，可重復給予原劑量匹魯卡品注射液，以5次為最高限。癲癇發(fā)作分級標準：參照Racine分級標準。無驚厥為0級；面部陣攣為Ⅰ級；面部陣攣+節(jié)律點頭為Ⅱ級；面部陣攣+節(jié)律點頭+前肢陣攣為Ⅲ級；面部陣攣+節(jié)律點頭+前肢陣攣+后肢站立為Ⅳ級；面部陣攣+節(jié)律點頭+前肢陣攣+后肢站立+跌倒為Ⅴ級。

1.3 小鼠認知功能測定 使用Morris水迷宮系統(tǒng)（包括水迷宮、電腦攝像系統(tǒng)及配套軟件分析系統(tǒng)；購自上海移碼數(shù)字有限公司）；水迷宮是一個直徑96 cm、高 50 cm的圓柱形水池，池中水深 40 cm、水溫（21.0±1.5）℃。（1）空間學習能力測定：采用定位航行試驗。迷宮共分成4個象限，在距水面下1 cm處放置在一個固定的水下平臺。所有小鼠接受連續(xù)5 d訓練[5]，每天進行4次空間習得實驗，每次訓練間隔時間60 min，記錄其尋找到水下平臺的時間，即逃避潛伏期。若60 s內(nèi)找到水下平臺，逃避潛伏期為小鼠找到水下平臺的時間；若未在規(guī)定時間內(nèi)找到平臺，則將小鼠輕輕引導至水下平臺停留10 s，逃避潛伏期為60 s。（2）記憶能力測定：采用空間探索試驗。第6天撤走水下平臺，任選一個入水點將小鼠放入水池中，使用水迷宮軟件記錄其在60 s內(nèi)的游泳軌跡，記錄小鼠穿越平臺次數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布的以 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；不符合正態(tài)分布的以 M（P25，P75）表示，多組間比較采用 Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Nemenyi檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠5 d內(nèi)逃避潛伏期比較 第1天癲癇組、甲氟喹組小鼠逃避潛伏期均明顯長于對照組（均P＜0.05），而癲癇組與甲氟喹組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；第2～5天，癲癇組、甲氟喹組小鼠逃避潛伏期均明顯長于對照組（均P＜0.05），但甲氟喹組均短于癲癇組（均P＜0.05），見表1。

表1 3組小鼠5 d內(nèi)逃避潛伏期比較（s）

2.2 3組小鼠穿越平臺次數(shù)比較 癲癇組、甲氟喹組小鼠第6天穿越平臺次數(shù)均明顯少于對照組（均P＜0.05），但甲氟喹組多于癲癇組（P＜0.05），見圖1。

圖1 3組小鼠穿越平臺次數(shù)比較（與對照組比較，*P＜0.05；與癲癇組比較，△P＜0.05）

3 討論

NMDA受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性氨基酸受體，在全腦都有分布，以海馬、大腦皮質(zhì)、紋狀體、杏仁體中的含量最高[6]。NMDA參與學習、記憶、癲癇、藥物依賴成癮及神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病等多種病理生理過程。NMDA是調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性的關(guān)鍵，NMDA受體離子通道的超極化激活環(huán)磷酸腺苷門控通道，導致神經(jīng)興奮性增加，從而發(fā)生癲癇，甚至癲癇持續(xù)狀態(tài)[7]，而癲癇發(fā)作后又可導致NMDA受體過度激活，引起細胞膜內(nèi)外離子失衡，激活神經(jīng)毒性信號傳導途徑，產(chǎn)生神經(jīng)毒性效應，使得神經(jīng)元損傷或死亡，最終導致認知功能嚴重受損。Inostroza等[8]研究發(fā)現(xiàn)氯化鋰-匹魯卡品癲癇大鼠的空間學習及記憶獲得及維持能力均明顯受損。但NMDA受體的適當激活有助于提高學習及記憶能力。NMDA受體在重復或長時間激活產(chǎn)生的NMDA通道后存在一個繼發(fā)的內(nèi)向電流，即使洗脫NMDA，該內(nèi)向電流依然存在。這一現(xiàn)象目前一直未得到合理解釋。Thompson等[2]在急性分離的海馬錐體神經(jīng)元實驗中發(fā)現(xiàn)，NMDAR受體激活后繼發(fā)的內(nèi)向電流系Panx1通道開放所致。Burma等[4]研究發(fā)現(xiàn)Pannx1通道抑制劑能產(chǎn)生類似抑制癲癇發(fā)作的作用。Silverman等[9]研究發(fā)現(xiàn)甲氟喹是Pannx1通道的良好阻滯劑。Velasquez等[10]研究發(fā)現(xiàn)甲氟喹能明顯抑制癲癇發(fā)作。既往研究顯示，NMDA受體在癲癇發(fā)作與學習、記憶等認知功能中均有重要作用，適當抑制NMDA受體活性也可以提高“致癇閾”，減少癲癇的發(fā)作頻率；同時能保護神經(jīng)元功能，也有利于防止癲癇患者認知功能的下降[11-12]。本實驗使用甲氟喹阻斷Panx1通道，以觀察小鼠癲癇發(fā)作時谷氨酸能神經(jīng)元的異常電活動對認知功能的影響，如影響變小或有改善作用，此通道或?qū)⒊蔀榭拱d癇藥物治療的重要靶點。

Morris水迷宮是英國心理學家Morris于1981年設(shè)計并應用于研究大腦學習記憶機制的一種實驗手段[13]，它主要用于評估空間學習和記憶能力[14-15]。隨著實驗的不斷改良，Morris水迷宮被認為是一種穩(wěn)健、可靠的測試[16]。經(jīng)典的Morris水迷宮測試程序主要包括定位航行試驗和空間探索試驗兩個部分，一般認為小鼠的標準訓練周期為5 d[17-19]。最近一項研究報道，海馬區(qū)膽堿能神經(jīng)元活動在訓練早期顯著增加[20]。Stafstrom等[1]對NMDA致癇模型大鼠進行水迷宮試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在出生后85 d的大鼠中，NMDA致癇組逃避潛伏期明顯長于對照組，提示NMDA對大腦發(fā)育期的大鼠致癇后，會導致其成年期空間記憶能力下降。在前期研究中，筆者發(fā)現(xiàn)甲氟喹能抑制癲癇小鼠海馬谷氨酸能神經(jīng)元的興奮性[21]。故本實驗以甲氟喹阻斷NMDA受體內(nèi)向電流為切入點，采用Morris水迷宮實驗來研究甲氟喹對急性癲癇發(fā)作小鼠空間學習及記憶能力的影響。本研究結(jié)果顯示，定位航行試驗第1天，癲癇組、甲氟喹組小鼠逃避潛伏期均明顯長于對照組，而癲癇組與甲氟喹組比較差異無統(tǒng)計學意義；第2～5天，癲癇組、甲氟喹組小鼠逃避潛伏期均明顯長于對照組，但甲氟喹組均短于癲癇組。第6天空間探索試驗中，癲癇組、甲氟喹組小鼠穿越平臺次數(shù)均明顯少于對照組，但甲氟喹組多于癲癇組。這說明癲癇發(fā)作后小鼠空間學習及記憶能力較正常小鼠均有所下降；而甲氟喹干預能使急性癲癇發(fā)作小鼠的空間學習及記憶能力均有所改善。

綜上所述，甲氟喹控制小鼠癲癇發(fā)作的同時，還能改善其空間學習及記憶能力，顯著提高癲癇小鼠的認知功能。然而，亦有研究證實在少數(shù)瘧疾患者中應用甲氟喹，可誘發(fā)癲癇發(fā)作[22-23]。由于甲氟喹作用于不同的靶點（如神經(jīng)元、星形細胞、鈉通道或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白），可表現(xiàn)出多種不同的不良反應[24]，這也導致其用于癲癇治療仍存在明顯的局限性。未來希望涌現(xiàn)出具有高選擇性的Panx1通道阻滯劑，在做到控制急性癲癇的同時，又能減少對患者認知功能的影響。