樸松哲 陳靜 洪濤 陳超前 周高波 柯莽

腺性膀胱炎（cystitis glandularis，CG）是一種以膀胱黏膜和下尿路上皮的腺上皮化生為特征的良性膀胱炎癥性病變，發(fā)病率為0.9%～1.9%[1]，臨床表現(xiàn)主要有膀胱刺激征、血尿、會陰部不適、性交痛等，較難治愈，易復(fù)發(fā)。因此，繼續(xù)探索治療CG的更有效方法十分必要。研究發(fā)現(xiàn)，慢性膀胱炎癥刺激是腺性膀胱炎的病因之一[2-3]。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CG患者行膀胱電切術(shù)后給予選擇性環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）抑制劑塞來昔布治療后病情得到有效控制，且免疫組化染色結(jié)果提示COX-2蛋白在CG組織中表達(dá)呈陽性[4-5]。該研究結(jié)果為探尋治愈CG的有效方法提供了新的方向。但是，目前關(guān)于塞來昔布治療CG的分子機制尚不清楚。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對塞來昔布治療CG的作用靶點及可能的分子機制作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 塞來昔布作用靶點分析 利用PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取塞來昔布（美國輝瑞公司，C17H14F3N3O2S）3D結(jié)構(gòu)和簡化分子現(xiàn)行輸入規(guī)范表達(dá)式（simplified molecular input line entry specification，SMILES）（CC1=CC=C（C=C1（C2=CC（=NN2C3=CC=C（C=C3）S（=O）（=O）N）C（F）（F）F），導(dǎo)入Swiss Target Prediction（http://www.swisstarget prediction.ch）數(shù)據(jù)庫，獲取藥物靶點。將藥物靶點導(dǎo)入UniProt（http://www.uniprot.org）數(shù)據(jù)庫，物種限定為人，將所有基因名校對為官方名稱（official symbol）。

1.2 CG相關(guān)基因分析 分別利用GeneCards（http://www.genecard.org）數(shù)據(jù)庫[6]和 CTD（http://ctdbase.org）數(shù)據(jù)庫[7]查詢與CG相關(guān)聯(lián)的基因集合。

1.3 塞來昔布治療CG靶點預(yù)測 將塞來昔布作用靶點基因集合與CG相關(guān)聯(lián)的基因集合取交集，并繪制Venn圖取交集，篩選塞來昔布治療CG可能的潛在靶點。

1.4 蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將上述基因集輸入GENEMANIA（http://genemania.org/）數(shù)據(jù)庫[8]構(gòu)建 PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 富集分析 通過DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫[9]，設(shè)定物種為人，閾值為P＜0.05、偽發(fā)現(xiàn)率≤0.05，對上述基因集功能進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encycopedia of genes and genomes，KEGG） 信號通路富集分析。運用R 3.6.0軟件ggplot2程序包繪制氣泡圖。

1.6 分子對接 利用PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/pdb/）獲取相應(yīng)靶點的人源蛋白三維結(jié)構(gòu)；利用ZINC數(shù)據(jù)庫獲取配體塞來昔布分子結(jié)構(gòu)；參考Bikadi等[10]的分子對接方法評估塞來昔布與CG潛在靶點的結(jié)合能，結(jié)合能＜0 kJ/mol表示配體與受體能夠自發(fā)結(jié)合，且該值越小表示結(jié)合能力越高。

2 結(jié)果

2.1 塞來昔布治療CG靶點分析結(jié)果 利用GeneCards、CTD數(shù)據(jù)庫查詢到與CG有關(guān)的靶點分別為253、21 964個，共篩選出塞來昔布治療CG潛在靶點共8個，即 PTGS1、PTGS2、MAPK14、CCND1、HRH1、PARP1、CDK1和 RAF1，見圖1（插頁）。

圖1 塞來昔布靶基因與腺性膀胱炎（CG）相關(guān)基因的Venn圖

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò) 利用GENEMANIA數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入上述8個基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)塞來昔布治療CG潛在治療靶點以及與其直接或減價作用的靶點共28個，靶點之間相互聯(lián)系達(dá)5種，見圖2（插頁）。

圖2 GENEMANIA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建塞來昔布治療腺性膀胱炎（CG）作用基因集合的蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

2.3 GO富集分析和KEGG信號通路富集分析 GO富集分析發(fā)現(xiàn)，塞來昔布治療CG的靶點分別富集在后隨鏈伸長、DNA修復(fù)、細(xì)胞分裂等生物學(xué)過程，細(xì)胞核、核漿、細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞組分，DNA連接酶活性、蛋白激酶結(jié)合、NAD+ADP核糖轉(zhuǎn)移酶活性等分子功能中；KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，該基因集主要富集在堿基切除修復(fù)、催產(chǎn)素信號通路、血管內(nèi)皮生長因子信號通路等信號通路上，見圖3（插頁）。

圖3 塞來昔布治療腺性膀胱炎（CG）靶基因集合的基因本體論（GO）富集分析及京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析

2.4 分子對接結(jié)果 分子對接結(jié)果顯示，塞來昔布與潛在靶點均有較好的結(jié)合能力。除PTGS2（COX-2）外，塞來昔布與CDK1的結(jié)合能力最高，與PTGS1的結(jié)合能力最低，見圖4（插頁）和表1。

圖4 塞來昔布與靶點分子對接（a：PTGS1；b：MAPK14；c：CCND1；d：HRH1；e：PARP1；f：CDK1；g：RAF1）

表1 塞來昔布與腺性膀胱炎（CG）潛在靶點的結(jié)合能（kJ/mol）

3 討論

目前CG治療尚無統(tǒng)一的方案。一種觀點主張保守治療，另一種觀點則認(rèn)為CG為癌前病變，主張予以電灼/電切術(shù)+化療藥物膀胱灌注[11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，COX-2在CG組織中高表達(dá)[12-14]。最近研究發(fā)現(xiàn)，CG患者行膀胱電切術(shù)后口服COX-2抑制劑塞來昔布后病情得到有效控制，且免疫組化染色發(fā)現(xiàn)COX-2蛋白在CG組織中表達(dá)呈陽性[4-5]。根據(jù)上述研究結(jié)果推測，COX-2異常表達(dá)可能與CG發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，COX-2抑制劑有望成為治療CG的新策略。

本課題組通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PTGS1、PTGS2、MAPK14、CCND1、HRH1、PARP1、CDK1和RAF1等8個基因是塞來昔布治療CG的潛在作用靶點。PTGS1、PTGS2是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素類、血栓烷類的關(guān)鍵酶，PG產(chǎn)物在炎癥、疼痛和血小板聚集等方面起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)CG組織中COX-2表達(dá)較正常膀胱組織增高，其中復(fù)發(fā)患者的 COX-2 表達(dá)顯著增高[15]。MAPK14（p38α）是 4 個p38 MAPKs之一，p38 MAPKs在在由促炎細(xì)胞因子或物理刺激等細(xì)胞外刺激所引發(fā)的細(xì)胞級聯(lián)反應(yīng)中起重要作用，p38α和TNF-α表達(dá)上調(diào)與尿路上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)[16]。CCND1基因編碼細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1，可抑制細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換。人膀胱平滑肌細(xì)胞內(nèi)CCND1可在LPS刺激下經(jīng)NF-κB信號表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，與慢性膀胱炎引起膀胱組織重建有關(guān)[17]。CG組織中CNND1表達(dá)較正常膀胱組織增高[17]。HRH1作為組胺最主要的受體壓型，廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)末梢，參與炎癥反應(yīng)、疼痛反應(yīng)、血管調(diào)節(jié)和肥胖等生理過程的調(diào)節(jié)[18]。此外，組胺通過HRH1直接增強COX-2的表達(dá)和功能，從而上調(diào)PGI2、PGE2水平[19]。PARP1是PARP家族中最主要成員，在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)DNA損傷時被激活，消耗大量NAD，繼而消耗ATP，導(dǎo)致細(xì)胞壞死；這說明抑制PARP1可通過減少細(xì)胞DNA損傷，從而對組織發(fā)揮保護(hù)作用[20]。研究發(fā)現(xiàn)，PARP-1在體內(nèi)外均能與COX-2啟動子區(qū)抑制元件-655/-632結(jié)合，與COX-2呈負(fù)相關(guān)，在調(diào)控COX-2表達(dá)中發(fā)揮重要作用[21]。CDK1主要與Cyclin A和Cycling B結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期[22]。RAF1是Raf激酶家族成員之一，RAS/RAF/MAPK信號通路是多種刺激誘導(dǎo)COX-2轉(zhuǎn)錄的必要信號通路，與細(xì)胞生存有關(guān)[23]。該結(jié)果提示塞來昔布可能通過多靶點治療CG。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，塞來昔布治療CG的預(yù)測靶基因集合分別富集在前列腺素內(nèi)過氧合酶活性、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性、蛋白激酶結(jié)合等分子功能上和蛋白質(zhì)定位、細(xì)胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)、磷酸鹽代謝等生物學(xué)過程中。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，該基因集合主要富集在細(xì)胞衰老、VEGF信號通路、內(nèi)分泌抵抗等信號通路中。分子對接結(jié)果驗證塞來昔布與其治療CG的潛在靶點均有較好的結(jié)合。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)合文獻(xiàn)復(fù)習(xí)篩選出塞來昔布治療CG潛在靶點共8個，這為進(jìn)一步探索塞來昔布治療CG的作用機制提供了理論依據(jù)。