王文靖，陳倩，張曉偉，劉彥，＊

（1.四川大學(xué)生物質(zhì)與皮革工程系，四川 成都 610065；2.四川大學(xué)制革清潔技術(shù)國家工程研究中心，四川 成都 610065）

前言

脫脂不僅需要去除生皮表面的油脂，同時(shí)還要將生皮內(nèi)部脂腺中的油脂以及游離脂肪細(xì)胞中的油脂除去，因此，要想徹底的去除油脂，皮革脫脂材料不僅需要具備良好的去污能力，還應(yīng)具有滲入皮層內(nèi)部將脂肪及脂腺細(xì)胞中的油脂遷出皮外的能力[1]。目前制革中主要是應(yīng)用表面活性劑進(jìn)行脫脂（又稱乳化法脫脂），不僅脫脂率較高，且對后工序具有良好的促進(jìn)作用，如利于堿液、酶制劑等的滲透，可以加速革纖維的分離，提高鞣液中鉻的吸收率以及起到勻染的作用等[2]。正因?yàn)楸砻婊钚詣┟撝哂腥绱硕嗟膬?yōu)點(diǎn)，因此受到制革工業(yè)的青睞。但是，在表面活性劑脫脂為我們帶來眾多方便時(shí)，其作為一類化工試劑，在使用過程中會造成COD值增大，帶來環(huán)境污染[3，4]。

酶是一種蛋白質(zhì)，同時(shí)也是一種具有生物催化活性的物質(zhì)，它無毒、對環(huán)境沒有污染，相比于化學(xué)催化劑，具有更高的催化效率。在日益注重環(huán)保及可持續(xù)發(fā)展的今天，酶法脫脂受到越來越多的關(guān)注和重視。但是，目前酶法脫脂的應(yīng)用還是受到一定的限制，主要原因是酶的價(jià)格較高、脫脂率較低，這也是造成脂肪酶脫脂在制革工業(yè)中沒有得到廣泛應(yīng)用的主要原因[5-7]。

本文研究生物柴油合成脂肪酶ZG與表面活性劑的相容性，主要是為了選擇對該脂肪酶具有明顯激活作用的表面活性劑與之進(jìn)行復(fù)配，結(jié)合酶法脫脂及表面活性劑脫脂各自的優(yōu)越性，以及兩者的協(xié)同效應(yīng)來達(dá)到更加理想的脫脂效果。旨在在提高脫脂效率的同時(shí)，大幅度減少表面活性劑的用量，以減輕環(huán)境污染。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

脂肪酶ZG工業(yè)級（出廠酶活3萬U/mL），勝達(dá)科技股份有限公司。吐溫20（AR），天津市美琳工貿(mào)有限公司；吐溫60（AR），成都市科龍化工試劑廠；吐溫80（AR），成都市科龍化工試劑廠；十二烷基苯磺酸鈉（AR），成都市科龍化工試劑廠；平平加O（LR），成都市科龍化工試劑廠；乳化劑OP-10（AR），成都市科龍化工試劑廠；十二烷基硫酸鈉（AR），成都市科龍化工試劑廠。鹽干綿羊皮，成都新世紀(jì)皮革有限公司；二氯甲烷(AR)，成都市科龍化工試劑廠；化學(xué)脫脂劑（工業(yè)級），成都市科龍化工試劑廠。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

BS-124S電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；WH-2微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；QZX-C空氣振蕩器，哈爾濱市東明醫(yī)療器械廠；81-2型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器廠；PHS-2C酸度計(jì)，上海大中分析儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同表面活性劑對酶活力的影響

表面活性劑質(zhì)量濃度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 g/L，用單因素實(shí)驗(yàn)，研究不同濃度的表面活性對酶活力的影響，確定出對脂肪酶ZG激活作用較強(qiáng)的表面活性劑種類。

1.2.2 利用響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化表面活性劑復(fù)配體系

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以O(shè)P-10濃度、LAS濃度和平平加O濃度為自變量，以脂肪酶ZG的酶活力為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，得到優(yōu)化后的表面活性劑體系，再與脂肪酶ZG復(fù)配。響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Response surface analysis test factor level table

1.2.3 脂肪酶ZG與表面活性劑體系復(fù)配方案優(yōu)化研究

將脂肪酶ZG稀釋不同倍數(shù)（×5、×6、×7、×8、×9、×10），再與由響應(yīng)面優(yōu)化得到的表面活性劑體系混合，采用銅皂法測酶活力，確定酶與表面活性劑復(fù)配的最優(yōu)方案。運(yùn)用Box-Behnken模型設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，并對擬合曲面的形狀進(jìn)行分析。

1.2.4 化學(xué)脫脂劑與復(fù)配酶脫脂效果比較實(shí)驗(yàn)

將綿羊皮一分為二，分別用化學(xué)脫脂劑和復(fù)配酶Es進(jìn)行脫脂。按照綿羊皮服裝革工藝，分別在預(yù)浸水、主浸水、脫灰以及軟化工序加入0.5%的化學(xué)脫脂劑，0.25%復(fù)配酶Es進(jìn)行對比試驗(yàn)。分別在四個(gè)工序結(jié)束時(shí)取樣，然后用索氏抽提法測定皮樣（沿著背脊線取樣）的油脂含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 表面活性劑的篩選

2.1.1 LAS、OP-10、平平加O對酶活力影響

由圖1可看出，當(dāng)陰離子表面活性劑LAS與脂肪酶ZG接觸時(shí)，在低質(zhì)量濃度（1~3 g/L）范圍時(shí)，隨著LAS濃度的增加，脂肪酶的活力逐漸增大并達(dá)到最大值；當(dāng)質(zhì)量濃度大于3 g/L后酶活力陡然下降；當(dāng)酶質(zhì)量濃度增加到為9 g/L時(shí)，酶活力降低了25%左右，說明LAS應(yīng)用的最佳質(zhì)量濃度應(yīng)為3 g/L。這是因?yàn)楫?dāng)LAS的濃度較低時(shí)，此時(shí)n值較小，形成的(R-B)n-E型復(fù)合物有利于脂肪酶水解甘油三酸酯。隨著LAS濃度的增加，n值增加，表面活性劑與同一酶分子結(jié)合的數(shù)目相應(yīng)增多，酶分子與表面活性劑作用增強(qiáng)而破壞酶的活性。

圖1 不同質(zhì)量濃度LAS、OP-10、平平加O對脂肪酶ZG活力的影響Fig.1 The effect of different concentrations of LAS、OP-10、PinpingaO on the activity of lipase ZG

由圖1可知，當(dāng)OP-10質(zhì)量濃度低于6 g/L時(shí)，隨著濃度的增加，酶活力緩慢增加；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到6 g/L時(shí)，酶活力達(dá)到最大值；隨著濃度的繼續(xù)增加，酶活力開始減??；當(dāng)質(zhì)量濃度增加到9 g/L時(shí)，其活力僅為最大酶活力的2/3左右。推測可能是當(dāng)酶濃度較低時(shí)，OP-10與酶的結(jié)合較弱，對酶構(gòu)象的影響較小，且還能在一定程度上穩(wěn)定酶的構(gòu)象，從而使酶活力增加；當(dāng)OP-10濃度增大時(shí)，它與酶的相互作用增強(qiáng)，從而影響酶的構(gòu)象，降低其穩(wěn)定性，使酶活力降低。因此OP-10應(yīng)用的最佳質(zhì)量濃度為6 g/L。

由圖1可看出，當(dāng)平平加O質(zhì)量濃度為3 g/L時(shí)，對脂肪酶的激活作用最強(qiáng)，此時(shí)酶活力達(dá)到最大值；隨著濃度的繼續(xù)增加，脂肪酶ZG活力逐漸下降；當(dāng)質(zhì)量濃度增加到9 g/L時(shí)，酶活力降低到最大酶活力的60%左右。因此平平加O應(yīng)用的最佳質(zhì)量濃度為3 g/L。

2.1.2 Tween20、Tween60、Tween80對酶活力影響

從圖2可以看出，Tween20在7 g/L質(zhì)量濃度下對脂肪酶的激活作用達(dá)到最大，濃度繼續(xù)升高，脂肪酶活力陡然下降，當(dāng)質(zhì)量濃度增加到9 g/L時(shí)，其活力僅為最大酶活力的一半?？梢奣ween 20應(yīng)用的最佳質(zhì)量濃度為7 g/L。

圖2 不同質(zhì)量濃度吐溫20、吐溫60、吐溫80對脂肪酶ZG活力的影響Fig.2 The effect of different concentrations of Tween20、Tween60、Tween80 on the activity of lipase ZG

由圖2可知，在一定范圍內(nèi)隨著Tween60濃度的增加，脂肪酶ZG活力逐漸增強(qiáng)，且在6 g/L時(shí)達(dá)到最大值；隨著濃度的進(jìn)一步升高，酶活力開始降低，且濃度越大，降低越明顯，酶活力越低。因此Tween60應(yīng)用的最佳質(zhì)量濃度為6 g/L。

由圖2可以得知，不同濃度Tween80對脂肪酶活性的影響呈一條較平滑的曲線，當(dāng)Tween80質(zhì)量濃度為4 g/L時(shí)，對酶活力的激活作用達(dá)到最大，因此Tween80應(yīng)用的最佳質(zhì)量濃度為4 g/L。

2.1.3 對脂肪酶ZG激活作用最好的表面活性劑的選擇

由表2可知，表面活性劑對酶的激活作用大小順序?yàn)椋篖AS(3 g/L)＞平平加O(3 g/L)＞OP-10(6 g/L)＞Tween80(4 g/L)＞Tween20(7 g/L)＞Tween60(6 g/L)?？梢奓AS、平平加O、OP-10對酶活力的促進(jìn)作用高于吐溫系列。LAS作為一類典型的陰離子表面活性劑，易溶于水，與非離子型表面活性劑的配伍性好，當(dāng)其質(zhì)量濃度為3 g/L時(shí)，其激活作用略優(yōu)于其余5種表面活性劑。而OP-10、平平加O為非離子型表面活性劑，當(dāng)其用量為6、3 g/L時(shí)，對酶也具有較強(qiáng)的激活作用。而對于吐溫系列，對脂肪酶ZG的激活作用較弱，且用量相對較大。因此充分考慮生產(chǎn)成本及作用效果等因素，選擇LAS、OP-10、平平加O這三種表面活性劑及其對應(yīng)的濃度，通過響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)找出三者的最佳復(fù)配方案，從而最大限度的提高酶活力。

表2 表面活性劑對脂肪酶ZG的最佳激活濃度以及對應(yīng)的酶活力Tab.2 The optimal activation concentration of surfactant for lipase ZG and the corresponding enzyme activity

圖4 平平加O及OP-10用量對脂肪酶ZG活力影響的等值線圖及曲面圖Fig.4 Contour plot and surface plot of the effect of Pinpinga O and OP-10 dosage on the activity of lipase ZG

圖5 平平加O及LAS用量對脂肪酶ZG活力影響的等值線圖及曲面圖Fig.5 Contour plot and surface plot of the effect of Pinpinga O and LAS dosage on the activity of lipase ZG

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析[7-10]

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值(脂肪酶活力)見表3。

表3 N=15的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Box-Behnken experimental design and results with N=15

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Minitab 16分析，得出脂肪酶ZG活力與OP-10、LAS、平平加O濃度關(guān)系的回歸方程：酶活力（U/mL）=21766.4+417A+4896.7B+1033.4C-121.2A2-706.3B2-219.7C2+49.6AB+159.8AC+5.9BC。

2.2.2 響應(yīng)面分析及表面活性劑濃度確定

混凝土的施工技術(shù)與澆筑質(zhì)量會影響水利水電施工的效率和質(zhì)量，在澆筑混凝土之前應(yīng)清洗模板內(nèi)的油污與雜物，將模板的縫隙與空洞堵嚴(yán)，并用清水濕潤木模板，確?；炷恋臐仓|(zhì)量。施工前應(yīng)校對模板的尺寸與標(biāo)高，保證鋼筋的安裝與綁扎能順利完成，確保鋼筋的配置、數(shù)量與保護(hù)層的厚度設(shè)置正確無誤。在澆筑混凝土?xí)r應(yīng)按照從低處向高處澆筑的原則來進(jìn)行，并按照設(shè)計(jì)的需要處理每層混凝土的厚度，確保其符合配筋設(shè)計(jì)與振搗要求[3]。澆筑時(shí)對留置施工縫有嚴(yán)格要求，這就需要在澆筑之前設(shè)置好施工縫的位置。

通過回歸方程繪制分析圖，對擬合曲面的形狀進(jìn)行分析考察，結(jié)果如圖3~5所示。

圖3 LAS及OP-10用量對脂肪酶ZG活力影響的等值線圖及曲面圖Fig.3 Contour plot and surface plot of the effect of LAS and OP-10 dosage on the activity of lipase ZG

利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件minitab 16，通過二次回歸設(shè)計(jì)得到了脂肪酶ZG活力與LAS、OP-10、平平加O濃度的回歸模型，經(jīng)檢驗(yàn)表明該模型是可靠的，能夠較好地預(yù)測脂肪酶活力變化。在對影響脂肪酶活力的因素及其相互作用進(jìn)行探討后，得到優(yōu)化的工藝參數(shù)為：OP-10質(zhì)量濃度為6 g/L，LAS質(zhì)量濃度為3.5 g/L、平平加O質(zhì)量濃度為4.5 g/L。將上述三種表面活性劑以一定比例混合，制得表面活性劑復(fù)配體系后再與酶復(fù)配。利用軟件得出酶的活力理論值為34 000 U/mL，而實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果為34 454 U/mL，可知理論值與實(shí)驗(yàn)值相差較小，說明利用響應(yīng)面分析方法對脂肪酶影響因素進(jìn)行優(yōu)化是可行的，同時(shí)在優(yōu)化的表面活性劑濃度基礎(chǔ)上，測得酶活力由原來的28 000 U/mL增加到34 454 U/mL，說明優(yōu)選出的表明活性劑體系對酶活力有較大的促進(jìn)作用。因此選用此表面活性劑體系與脂肪酶ZG進(jìn)行復(fù)配。

2.3 脂肪酶ZG與表面活性劑復(fù)配方案優(yōu)化研究

通過響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，得到了對脂肪酶ZG激活最強(qiáng)的表面活性劑體系即OP-10質(zhì)量濃度為6 g/L，LAS質(zhì)量濃度為3.5 g/L、平平加O質(zhì)量濃度為4.5 g/L。將脂肪酶ZG稀釋一定倍數(shù)，再與該表面活性劑體系以一定比例混合，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6示。

由圖6可以看出，將脂肪酶ZG稀釋一定倍數(shù)后再與表面活性劑體系混合，隨著酶液稀釋倍數(shù)的增加，酶活力增長率出現(xiàn)先增大再減小的趨勢。當(dāng)酶液稀釋倍數(shù)較低，即酶濃度較高時(shí)，酶分子相對于表面活性劑而言是過量的，從而一部分酶分子未能與表面活性劑作用，表現(xiàn)為酶活力增長率較低；當(dāng)稀釋倍數(shù)增加到7倍時(shí)，表面活性劑恰好與酶分子充分反應(yīng)，對酶的激活作用最強(qiáng)，激活率約為27%；隨著稀釋倍數(shù)的進(jìn)一步增加，即酶濃度進(jìn)一步的降低，表面活性劑相對于酶分子而言是過量的，從而一部分表面活性劑未能與酶作用，表現(xiàn)為酶活力增長率下降。當(dāng)酶稀釋7倍再與表面活性劑體系復(fù)配，效果最好。

圖6 酶稀釋倍數(shù)與酶活增長率關(guān)系Fig.6 The relationship between enzyme dilution ratio and enzyme activity growth rate

由此得到脂肪酶ZG與表面活性劑體系復(fù)配的較佳配比為脂肪酶ZG稀釋7倍后，再與表面活性劑體系復(fù)配，得到復(fù)配酶制劑命名為：Es（脂肪酶ZG+表面活性劑體系），酶活力較復(fù)配前增加了27%，達(dá)到35 560 U/mL。

2.4 復(fù)配前后對比

復(fù)配酶Es由脂肪酶ZG+表面活性劑體系（OP-10質(zhì)量濃度為6 g/L，LAS質(zhì)量濃度為3.5 g/L、平平加O質(zhì)量濃度為4.5 g/L）構(gòu)成。這三種表面活性劑的批發(fā)市場價(jià)格（百度網(wǎng)）分別為OP-10：16元/kg，LAS：12元/kg，平平加O：14元/kg。由此計(jì)算出復(fù)配酶Es的成本價(jià)大概為：

由表4可以看出，復(fù)配后不僅酶活力有大幅度提升，增加了27%，而且成本也大幅下降了，降低了85.6%。因此直觀可以看出復(fù)配效果較好。

表4 復(fù)配前后對比Tab.4 Comparison of parameters before and after compounding

表5的兩種脫脂劑在四個(gè)工序的脫脂數(shù)據(jù)表明，當(dāng)復(fù)配脂肪酶Es的用量為化學(xué)脫脂劑一半時(shí)，酶的脫脂率均略高于化學(xué)脫脂劑。復(fù)配酶的最終脫脂率可達(dá)到70.26%，比化學(xué)脫脂劑高3.78%，比傳統(tǒng)酶法50%左右的脫脂率有了較大的增幅，說明將脂肪酶與表面活性劑復(fù)配后用于脫脂操作是可行的。

表5 脫脂應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of degreasing applicatin test

見表6所示，用復(fù)配脂肪酶Es脫脂，表面活性劑的量相對于化學(xué)脫脂劑減少了99.3%，說明脂肪酶ZG與表面活性劑復(fù)配后，極大地減少了表面活性劑的用量，同時(shí)協(xié)同作用使得脂肪酶的活力增強(qiáng)，在用量為化學(xué)脫脂劑的一半的情形下，仍然具有較強(qiáng)的脫脂能力。通過復(fù)配，酶的應(yīng)用成本比化學(xué)脫脂還低32.67%，因此推廣應(yīng)用前景廣闊。

表6 復(fù)配酶與化學(xué)脫脂劑的成本及用量對比（以下數(shù)據(jù)均以生產(chǎn)100 kg皮計(jì)）Tab.6 Comparison of the cost and dosage of compounding enzyme and chemical degreaser(Based on 100 kg sheep skins)

3 結(jié)論

（1）對脂肪酶ZG具有較強(qiáng)激活作用的表面活性劑為：LAS、平平加O、OP-10。采用響應(yīng)面優(yōu)化法對上述三種表面活性劑的激活濃度優(yōu)化結(jié)果表明，OP-10為6 g/L、LAS為3.5 g/L、平平加O為4.5 g/L。最優(yōu)參數(shù)下的酶活力預(yù)測值為34 000 U/mL，實(shí)驗(yàn)測得酶活力為34 454 U/mL，可見預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值相差較小。

（2）脂肪酶ZG與表面活性劑體系復(fù)配方案優(yōu)化研究表明，脂肪酶ZG稀釋7倍后再與表面活性劑體系進(jìn)行復(fù)配效果最好。相對于初始酶活力增長了27%，達(dá)到35 560 U/mL；成本下降了85.6%。

（3）脫脂應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)配脂肪酶Es的用量為化學(xué)脫脂劑一半時(shí)，復(fù)配酶的最終脫脂率可達(dá)到70.26%，比化學(xué)脫脂劑高3.78%；應(yīng)用復(fù)配脂肪酶Es脫脂，表面活性劑的量相對于化學(xué)脫脂劑減少了99.3%，復(fù)配酶的應(yīng)用成本比化學(xué)脫脂低32.67%，因此清潔和環(huán)保，推廣應(yīng)用前景廣闊。