田立群，雷杰，祝煒，馮瑩，張妍，董瑩，柯于鶴

(1.武漢市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，武漢 430022；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，武漢 430060)

心血管疾病已經(jīng)成為全球首位致死疾病，每年死于心血管疾病的人數(shù)多于其他任何疾病[1]。盡早進行再灌注治療目前已成為改善心肌缺血損傷的有效方法，且能有效降低心肌梗死死亡率，但需要注意的是血供改善后出現(xiàn)心肌損傷加重的情況，即心肌缺血-再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷[2]。心肌I/R損傷的發(fā)生與多種病理機制[3]包括氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)超載、炎癥反應(yīng)加劇、線粒體功能障礙和細(xì)胞自噬等密切相關(guān)。近年來細(xì)胞凋亡對心肌功能的影響及I/R損傷的發(fā)生逐漸成為研究熱點。心肌細(xì)胞受損導(dǎo)致凋亡誘導(dǎo)因子、細(xì)胞色素C等從細(xì)胞內(nèi)釋放，加速細(xì)胞凋亡進程[4-5]，并對心肌造成不可逆性損傷。蔥白提取物(fistular onion bulb，F(xiàn)OB)是從華夏小蔥白莖中提取的有效物質(zhì)，主要活性成分為硫化物、黃酮類化合物、甾體皂苷、不飽和脂肪酸等。本課題組前期研究工作發(fā)現(xiàn)FOB能明顯縮小大鼠I/R損傷的心肌梗死面積，改善炎癥反應(yīng)和缺氧狀態(tài)，恢復(fù)正常心功能[6-7]。為進一步研究FOB對I/R損傷的保護機制，筆者構(gòu)建I/R損傷大鼠模型，從細(xì)胞凋亡角度探討FOB對I/R損傷大鼠的保護作用及其可能的機制，以期為臨床防治心肌I/R損傷提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級成年SD大鼠60只，體質(zhì)量200～220 g，由湖北省實驗動物研究中心提供，動物使用許可證號：SYXK(鄂)2017-0067。大鼠飼養(yǎng)于恒溫(23～25 ℃)、恒濕(相對濕度50%～60%)動物房。本實驗過程對動物的處置均符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2藥物與試劑 FOB(武漢市第一醫(yī)院提供，批號：20170326)，硝酸甘油片(山東信誼制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H37021445)。 大鼠B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bax)、β微管蛋白(β-tubulin) 抗體(Cell Signaling公司，批號分別為：#3498，#2774，#2146)，細(xì)胞色素C(Cyt-C)抗體、凋亡酶激活因子1(Apaf-1)抗體(Abcam，批號分別為：ab13575，ab2001)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG 抗體(CST公司，批號為：#7074)，肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：A032-1-1，A020-2-2，H197)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green RT-qPCR 試劑盒(武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號：RK20400，RK20404)，引物由武漢谷歌生物有限公司合成，其余試劑均為市售分析純。

1.1.3儀器 超凈工作臺(Heraguard型，美國Thermo公司)，超低溫冰箱[MDF-U32V(N)型，日本SANYO公司]，組織包埋機(EG1150型，德國Leica公司)，組織切片機(CV5030型，德國Leica公司)，倒置顯微鏡(DMi8型，德國Leica公司)，高速冷凍離心機(5910R型，德國Eppendorf公司)，凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc XR型，美國伯樂公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組與給藥 實驗前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按照隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、I/R組、FOB小劑量(300 mg·kg-1)+ I/R組、FOB中劑量(600 mg·kg-1)+ I/R組、FOB大劑量(1200 mg·kg-1)+I/R組、硝酸甘油(600 mg·kg-1)+I/R組，每組10只。給藥劑量為2 mL·kg-1，每天灌胃1次，連續(xù)14 d，假手術(shù)組和I/R組給予等容積純化水。

1.2.2大鼠I/R損傷模型建立 參考宋忠陽等[8]介紹的方法建立大鼠I/R損傷模型。10%戊巴比妥鈉3 mL·kg-1麻醉大鼠并固定，氣管切開后接入人工呼吸機進行機械通氣，隨后打開胸腔，充分暴露心臟，找到冠狀動脈，于左心耳下緣與肺動脈圓錐間距主動脈根部約2 mm處進針結(jié)扎左冠狀動脈前降支，以心電圖QRS波加大和ST抬高作為缺血成功的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)扎30 min后松開結(jié)扎線實施再灌注24 h。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，其余各組操作同I/R組。造模過程中死亡大鼠予以補足，確保每組有10只大鼠造模成功。

1.2.3心功能檢測 再灌注24 h后，行左側(cè)頸總動脈插管至左心室，通過多導(dǎo)生理記錄儀進行數(shù)據(jù)采集和分析左心室功能變化。檢測指標(biāo)：心率(HR)、左心室短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)、射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)以及早期舒張波(Em)/晚期舒張波(Am)。

1.2.4血清樣本采集 檢測左心室功能后，打開腹腔行腹主動脈取血，4 ℃靜置0.5 h，5000 r·min-1(r=13.5 cm)離心10 min，分離血清置于超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5心肌酶譜檢測 將凍存?zhèn)溆玫难宄亟鈨?，再次離心15 000 r·min-1(r=4.0 cm)10 min后取上清液，ELISA法檢測大鼠血清CK、LDH和CK-MB濃度，具體操作按說明書嚴(yán)格進行。

1.2.6Western blotting檢測Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) 取心肌組織加入適量蛋白裂解液反應(yīng)10 min，15 000 r·min-1(r=4.0 cm)離心15 min取上清液，取25 μL按照二喹啉甲酸法行濃度測定。隨后進行SDS-PAGE凝膠垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)100 V電泳60 min，100 V轉(zhuǎn)膜140 min，5%脫脂奶粉封閉60 min，TBST緩沖液洗3次，每次10 min。加入Bax、Bcl-2一抗(稀釋濃度1：1000)，4 ℃孵育過夜后洗滌3次，每次10 min，隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG(稀釋濃度1：1000)，并室溫孵育60 min，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min。電化學(xué)發(fā)光顯影，Tanon-5200全自動發(fā)光成像分析系統(tǒng)攝片，采用Image J對蛋白條帶進行灰度值測定。

1.2.7實時-聚合酶鏈反應(yīng)(real time-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá) 取凍存?zhèn)溆眯募〗M織100 mg，Trizol法提取各組總RNA，測定RNA濃度及純度。將總RNA 1 μg按試劑盒說明書操作步驟進行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；PCR反應(yīng)體系為20 μL：10×擴增緩沖液10 μL、上下游引物(表1)各0.4 μL和cDNA模板0.5 μL混合加超純水至20 μL；PCR擴增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性45 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共25個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取RT-PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳(含溴化乙錠0.5 μg·mL-1)，GDS凝膠成像并分析Bax、Bcl-2 mRNA吸光度與β-actin mRNA吸光度的比值計算相對表達(dá)量。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.2.8免疫熒光檢測Cyt-C和Apaf-1的表達(dá) 心肌組織經(jīng)石蠟切片脫蠟水化，3%過氧化氫(H2O2)孵育，以0.01 mol·L-1枸櫞酸鹽煮沸，加入正常山羊血清室溫封閉。滴加Cyt-C、Apaf-1抗體(1：200)，4 ℃濕盒孵育過夜(陰性對照加磷酸鹽緩沖液)，次日滴加熒光二抗標(biāo)記(1：100)37 ℃濕盒孵育1 h，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚復(fù)染核。封片后1 h內(nèi)熒光顯微鏡觀察和拍照，圖像轉(zhuǎn)件Image-Pro Puls 6.0分析各組熒光積分吸光度值。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠心功能變化的比較 見表2，與假手術(shù)組比較，I/R組EF、FS和Em/Am值明顯下降(P<0.05)，顯示心功能明顯受損；與I/R組比較，F(xiàn)OB小、中、大劑量+I/R組以及硝酸甘油+I/R組EF、FS及Em/Am比值均不同程度升高(P<0.05)，F(xiàn)OB+I/R各組心功能明顯改善。

表2 6組大鼠心功能變化Tab.2 Cardiac function changes in six groups of rats

2.2各組大鼠血清CK、LDH和CK-MB水平比較 與假手術(shù)組比較，I/R組大鼠血清CK、LDH和CK-MB水平均顯著升高(P<0.05)；與I/R組比較，F(xiàn)OB小、中、大劑量+I/R組血清CK、LDH和CK-MB水平均有不同程度降低(P<0.05)，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系(表3)。

表3 6組大鼠血清CK、LDH、CK-MB水平比較Tab.3 Comparison of serum levels of CK，LDH and CK-MB among six groups of rats

2.3FOB對各組Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 如圖1和表4所示，與假手術(shù)組比較，I/R組Bax蛋白表達(dá)顯著升高，而Bcl-2 蛋白表達(dá)則顯著降低，Bax/Bcl-2值明顯升高(P<0.05)；與I/R組比較，F(xiàn)OB小、中、大劑量+I/R組Bax蛋白表達(dá)量下降，而Bcl-2 蛋白表達(dá)則顯著增加，同時Bax/Bcl-2值則明顯下降(P<0.05)，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

表4 6組大鼠Bax和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平比較Tab.4 Comparison of the protein expression of Bax and Bcl-2 among six groups of rats

2.4FOB對各組Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 如圖2所示，與假手術(shù)組比較，I/R組Bax mRNA相對表達(dá)水平升高，Bcl-2 mRNA相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與I/R組比較，經(jīng)FOB預(yù)處理后，小、中、大劑量+I/R組Bax mRNA相對表達(dá)水平呈現(xiàn)不同程度下降，而Bcl-2 mRNA相對表達(dá)水平則明顯升高(P<0.05)。

A.假手術(shù)組；B.I/R組；C.FOB小劑量+ I/R組；D.FOB中劑量+I/R組；E.FOB大劑量+I/R組；F.硝酸甘油+I/R組。圖1 6組大鼠Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)A.sham group；B.I/R group；C.FOB low dose + I/R group；D.FOB medium dose + I/R group；E.FOB high dose + I/R group；F.nitroglycerin + I/R group.Fig.1 Protein expression of Bax and Bcl-2 in six groups of rats

2.5FOB對各組大鼠Cyt-C、Apaf-1蛋白表達(dá)的影響 如圖3所示，與假手術(shù)組比較，I/R組Cyt-C和Apaf-1蛋白表達(dá)均明顯增加(P<0.05)；與I/R組比較，F(xiàn)OB小、中、大劑量+I/R組以及硝酸甘油+I/R組的Cyt-C和Apaf-1蛋白陽性表達(dá)均顯著降低(均P<0.05)，其中FOB中、大劑量+I/R組降低更加明顯。

A.假手術(shù)組；B.I/R組；C.FOB小劑量+ I/R組；D.FOB中劑量+I/R組；E.FOB大劑量+I/R組；F.硝酸甘油+I/R組。①與假手術(shù)組比較，t=3.85，8.63，P<0.05；②與I/R組比較，t=2.36～7.52，P<0.05。圖2 6組大鼠Bax和Bcl-2 mRNA 的表達(dá)水平及半定量分析A.sham group；B.I/R group；C.FOB low dose + I/R group；D.FOB medium dose + I/R group；E.FOB high dose + I/R group；F.nitroglycerin + I/R group.①Compared with sham group，t=3.85，8.63，P<0.05；②Compared with I/R group，t=2.36—7.52，P<0.05.Fig.2 The mRNA expression and semi-quantitative analysis of Bax and Bcl-2 in six groups of rats

3 討論

心肌缺血發(fā)生后，氧和能量供應(yīng)障礙會導(dǎo)致乳酸和磷酸鹽等大量堆積，影響心肌正常功能，嚴(yán)重者損傷心肌細(xì)胞，造成細(xì)胞壞死等不可逆性改變。盡早進行再灌注治療成為降低心肌損傷的有效方法，但需要注意的是血供改善后發(fā)生心肌損傷加重的情況，即心肌I/R損傷。中醫(yī)藥在心血管疾病的治療中積累了大量的理論與實踐經(jīng)驗。張仲景在《金匱要略》記載：“夫脈當(dāng)取太過不及，陽微陰弦，即胸痹而痛”，胸痹病是對目前心血管疾病的概括，同時將辛溫通陽法確立為胸痹的治則[9]。又《類證治裁·胸痹》言：“胸痹，胸中陽微不運，久則陰乘陽位，而為痹結(jié)也?！笨梢娺\用辛溫的中藥振奮心陽是醫(yī)家們的共識。蔥白作為辛溫通陽的代表性中藥，具有鼓舞心脈、溫通心陽的作用。利用現(xiàn)代制劑技術(shù)，將FOB運用于臨床，取得了較好療效。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OB在抗心肌缺血、降脂治療方面療效確切。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)FOB具有抗氧化，改善炎癥反應(yīng)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗心肌I/R損傷的作用[10-12]。已有前期實驗證實，F(xiàn)OB可通過降低I/ R心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度、調(diào)節(jié)p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路蛋白的表達(dá)來發(fā)揮改善I/R大鼠心功能作用。

A.假手術(shù)組；B.I/R組；C.FOB小劑量+I/R組；D.FOB中劑量+I/R組；E.FOB大劑量+I/R組；F.硝酸甘油+I/R組。①與假手術(shù)組比較，t=3.78，15.11，P<0.05；②與I/R組比較，t=3.05～7.81，P<0.05。圖3 6組大鼠Cyt-C和Apaf-1的熒光表達(dá)及積分吸光度(n=10)A.sham group；B.I/R group；C.FOB low dose + I/R group；D.FOB medium dose + I/R group；E.FOB high dose + I/R group；F.nitroglycerin + I/R group.①Compared with sham group，t=3.78，15.11，P<0.05；②Compared with I/R group，t=3.05—6.78，P<0.05.Fig.3 Fluorescence expression and integral absorbance analysis of Cyt-C and Apaf-1 in six groups of rats(n=10)

細(xì)胞凋亡是I/R損傷發(fā)病的一個重要環(huán)節(jié)，細(xì)胞凋亡伴隨著其發(fā)展的全過程，且成年心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，細(xì)胞的凋亡必將導(dǎo)致心肌收縮成分的喪失而影響I/R損傷的嚴(yán)重程度。與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因主要包括2種[13]：一種為前凋亡蛋白，有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，如Bax等；另一種為抗凋亡蛋白，與前者作用相反，可以通過與前凋亡蛋白結(jié)合發(fā)揮抗凋亡和細(xì)胞保護作用，如Bcl-2等。正常狀態(tài)下，Bcl-2與Bax處于動態(tài)平衡，而當(dāng)機體受外界影響，如I/R發(fā)生時，細(xì)胞內(nèi)氧自由基增多和Ca2+超載等作用影響，Bcl-2與Bax平衡狀態(tài)被打破，此時細(xì)胞核內(nèi)促凋亡基因Bax高表達(dá)且蛋白表達(dá)隨之上調(diào)，心肌細(xì)胞會啟動凋亡程序[14-15]。細(xì)胞凋亡是一個程序性細(xì)胞死亡過程，Cyt-C在凋亡進程中發(fā)揮重要作用[16]。當(dāng)Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比值下調(diào)，進而影響線粒體膜通透性，增加線粒體Cyt-C的釋放，Cyt-C可與Apaf-1結(jié)合形成凋亡體多聚體復(fù)合物，啟動并激活Caspase家族，引發(fā)Caspase級聯(lián)瀑布式反應(yīng)，因此Cyt-C與Apaf-1的激活是發(fā)生細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟[17]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OB預(yù)處理首先改善了I/R損傷大鼠的心功能，并且在不同程度降低了CK、LDH和CK-MB水平，發(fā)揮了對心肌I/R損傷的保護作用；同時FOB不同劑量組均能夠不同程度降低Bax蛋白及mRNA表達(dá)，同時明顯增加Bcl-2 蛋白及mRNA表達(dá)，而參與凋亡進程的關(guān)鍵蛋白Cyt-C和Apaf-1表達(dá)也顯著降低，表明FOB可以通過減少或抑制I/R損傷導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗心肌I/R損傷的作用。這也提示，抗心肌細(xì)胞凋亡是緩解I/R損傷、改善心功能的重要方法。

綜上所述，本研究表明ROB預(yù)處理對心肌I/R損傷具有保護作用，其可能機制是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax表達(dá)水平，從而降低凋亡相關(guān)因子Cyt-C和Apaf-1表達(dá)，最終減少心肌細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其對心肌I/R損傷的保護作用。對心肌I/R損傷具有保護作用的最佳FOB濃度有待進一步研究。