趙樂，劉海霞，劉濤，竇殿奎，張晨曦，王超群，3，王永輝，王旭文

(1.山西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，晉中 030619；2.山西振東生物制藥有限公司，晉中 030600；3.湖北中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，武漢 430065)

腦震蕩屬于原發(fā)性顱腦損傷中常見的輕度腦損傷，多見于交通意外、運動、軍隊訓練、爆破等?；颊咴陬^部受到劇烈撞擊后出現(xiàn)的意識障礙、記憶力缺失、及惡心、嘔吐等[1]在休息后可恢復，但部分患者會留有頭痛、眩暈、失眠[2-4]等后遺癥。腦震寧方于2017年入選首批“山西名藥”名錄，為行氣活血、養(yǎng)心安神的有效方劑。臨床研究證實，其對腦外傷和顱內血腫等有確切療效，且對腦震蕩后出現(xiàn)的頭痛、頭暈、健忘、失眠等均有緩解作用[5]。本實驗探討腦震寧方對腦震蕩神經(jīng)元結構和功能相關介質的作用，為腦震蕩的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級SD大鼠，體質量(170±10) g，64只，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0006，合格證號：11400700352037。實驗通過山西中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準，大鼠飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學實驗中心動物房，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(22±2) ℃，濕度(50±10)%，24 h晝夜節(jié)律光照。適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

1.1.2藥材與試劑 腦震寧顆粒(山西振東安特生物制藥有限公司，批號：201803)，吡拉西坦(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號：6180306)，甲苯胺藍染液(北京雷根生物技術有限公司，批號：1031A18)，Weil 髓鞘染色液(Bioswamp公司，批號：CY1710)，誘導型一氧化氮合成酶(institute nacional de obras sanitarias，iNOS)、基質金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP-9)、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、白細胞介素6( IL-6)一抗(Bioswamp公司，批號：PAB43765，PAB40457，PAB32097，PAB40563)，二抗試劑盒(武漢博士德公司，批號：12L2B)，二氨基聯(lián)苯胺顯色劑(Bioswamp，批號：PAB180021)，Trizol(Ambion公司，批號：15596026)，YBR Green PCR 試劑盒(KAPA Biosystems公司，批號：KM4101)，逆轉錄試劑盒(Takara公司，批號：639505)。

1.1.3儀器 組織包埋機及冷凍機(泰維科技有限公司，TB-718D，TB-718L)，石蠟切片機(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司，RM2235)，恒溫烘箱(上海恒一科學儀器有限公司，DHG-9023A)，正置顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司，DM1000)，熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)儀(BIO-RAD公司)。

1.2方法

1.2.1模型制備 按照隨機數(shù)字表法隨機選取54只大鼠，采用金屬單擺閉合式[6-7]擊打大鼠腦顳部，角度70 °，制備單純性腦震蕩大鼠模型，同時滿足下列條件者納入實驗模型：①大鼠受撞擊后即刻出現(xiàn)一過性呼吸頻率減慢或暫停，但不超過20 s逐漸恢復呼吸節(jié)律；②翻正反射消失，但不超過3 min，恢復后無運動障礙。

1.2.2分組及給藥 將造模成功的50只大鼠采用隨機數(shù)字表法分為5組，依次為模型對照組，吡拉西坦組和腦震寧小、中、大劑量組，每組10只。造模24 h后，各組大鼠分別灌服相應藥物，劑量(根據(jù)藥理實驗大鼠和人體給藥體表面積公式換算)分別為：腦震寧大、中、小劑量組10.0，5.0，2.5 g·kg-1，吡拉西坦組0.324 g·kg-1，每天1次。另取正常大鼠10只作為正常對照組。正常對照組和模型對照組大鼠分別灌胃等體積純化水，均連續(xù)21 d。

1.2.3指標檢測

(1)一般狀態(tài)觀察。每日觀察大鼠自主活動行為，攝食量、飲水量、皮膚毛色變化等。

(2)取材。末次給藥24 h后，麻醉大鼠處死后，冰盤中開顱取腦組織，4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，切片后待染色。

(3)Weil氏染色觀察髓鞘分布。對空白切片組織行常規(guī)Weil氏染色，顯微鏡下觀察大腦胼胝體、腦干、小腦白質等部位神經(jīng)髓鞘排列。

(4)甲苯胺藍染色檢測尼氏體表達。常規(guī)甲苯胺藍染色，顯微鏡下觀察腦組織內尼氏體表達，并利用Image-6.0對尼氏體平均吸光度進行分析。

(5)免疫組化檢測腦組織iNOS、IL-6、GFAP和MMP-9蛋白表達。對切片組織進行常規(guī)免疫組化染色后(一抗?jié)舛染鶠?：300)，顯微鏡下觀察并分析組織IL-6、iNOS、GFAP和MMP-9的陽性表達。

(6)RT-PCR檢測腦組織細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、IL-6和MMP-9 mRNA表達。對腦組織海馬取材后，依次進行總RNA提取、反轉錄、基因擴增，以2-△△CT法計算各指標的mRNA表達。PCR擴增條件為：95 ℃，10 min；60 ℃，60 s；72 ℃，5 min；40個循環(huán)。β-actin為內參，IL-6、ERK和MMP-9引物序列見表1。

表1 ERK、IL-6和MMP-9 引物序列Tab.1 Primer sequences of ERK，IL-6 and MMP-9

2 結果

2.1腦震寧方對腦震蕩模型一般狀況的影響 實驗期間，模型對照組大鼠精神躁狂，警惕性增強，被毛萎黃臟亂，攝食減少；各給藥組大鼠隨給藥時間延長狂躁表現(xiàn)逐漸改善，攝食逐漸增加。

正常對照組大鼠各部位神經(jīng)髓鞘排列整齊，無斷裂、彎曲腫脹等現(xiàn)象；模型對照組神經(jīng)髓鞘排列紊亂，甚至彎曲腫脹、變形或斷裂；各治療組大鼠髓鞘彎曲腫脹減輕，其中吡拉西坦組和腦震寧中、大劑量組大鼠神經(jīng)髓鞘破壞恢復程度較好，見圖1。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.吡拉西坦組；D.腦震寧小劑量組；E.腦震寧中劑量組；F.腦震寧大劑量組。圖1 6組大鼠腦組織神經(jīng)髓鞘排列(Weil氏染色，×200)A.normal control group；B.model control group；C.piracetam group；D.Naozhenning low dose group；E.Naozhenning medium dose group；F.Naozhenning high dose group.Fig.1 Arrangement of nerve myelin sheath in brain tissues of six groups of rats(Weil stain，×200)

2.2腦震寧方對腦震蕩模型腦組織內尼氏體表達(吸光度)的影響 正常對照組腦組織神經(jīng)元細胞質內尼氏體深藍色；模型對照組較正常對照組神經(jīng)元尼氏體顯著減少(P<0.05)，且染色淡淺；各治療組大鼠神經(jīng)元尼氏體染色加深，與模型對照組比較，吡拉西坦組和腦震寧小、中劑量組尼氏體顯著增加(P<0.05)，見表2和圖2。

表2 6組大鼠腦組織尼氏體的表達(吸光度)Tab.2 Expression of Nissl body in brain tissues of six groups of rats(absorbance)

2.3腦震寧方對腦震蕩模型腦組織IL-6、iNOS、GFAP和MMP-9陽性表達的影響 見圖3，GFAP、iNOS、IL-6和MMP-9陽性表達呈現(xiàn)淡黃或棕黃色，iNOS和IL-6主要分布在細胞質內，MMP-9主要分布在細胞膜上，GFAP在細胞質和細胞膜均有分布。與正常對照組比較，模型對照組腦組織GFAP、iNOS、IL-6和MMP-9表達顯著升高(P<0.05)；與模型對照組比較，各治療組GFAP、iNOS表達顯著降低(P<0.05)，同時，除腦震寧中劑量組外，各用藥組IL-6、MMP-9表達顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 6組大鼠腦組織GFAP、IL-6、iNOS和MMP-9的表達(吸光度)Tab.3 Expressions of GFAP，IL-6，iNOS and MMP-9 in brain tissues of six groups of rats(absorbance)

2.4腦震寧方對腦震蕩模型海馬ERK、IL-6和MMP-9 mRNA表達的影響 與正常對照組比較，模型對照組ERK、IL-6和MMP-9 mRNA表達均顯著升高(均P<0.05)。與模型對照組比較，各治療組IL-6表達均顯著降低(均P<0.05)，同時，吡拉西坦組和腦震寧中劑量組ERK、MMP-9 mRNA表達均顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 6組大鼠腦組織ERK、IL-6和MMP-9 mRNA的相對表達Tab.4 Relative expression of ERK，IL-6 and MMP-9 mRNA in brain tissues of six groups of rats

3 討論

腦震蕩臨床常表現(xiàn)為一過性眩暈、昏迷、記憶缺失，未見腦部影像學異常，導致其在臨床診治中未予以足夠重視?，F(xiàn)代病理學研究認為，其發(fā)生伴隨腦組織神經(jīng)細胞損傷。神經(jīng)元及其軸突是神經(jīng)信號形成和信息傳遞的重要環(huán)節(jié)，腦震蕩發(fā)生后如未及時救治，出現(xiàn)腦組織缺血缺氧以及炎癥反應等，造成腦組織充血以及細胞變性和壞死等為主的神經(jīng)元損傷[8]，發(fā)生情感和認知障礙等[9]。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.吡拉西坦組；D.腦震寧小劑量組；E.腦震寧中劑量組；F.腦震寧大劑量組。圖2 6組大鼠腦組織尼氏體的表達(甲苯胺藍染色，×200)A.normal control group；B.model control group；C.piracetam group；D.Naozhenning low dose group；E.Naozhenning medium dose group；F.Naozhenning high dose group.Fig.2 Expression of Nissl body in brain tissues of six groups of rats(toluidine blue staining，×200)

腦震寧方中地黃和當歸滋陰養(yǎng)血，丹參、丹皮和川芎行氣活血化瘀，酸棗仁、柏子仁安神養(yǎng)血寧心，佐以陳皮、茯苓和竹茹和胃止嘔，全方共奏行氣活血、養(yǎng)血安神、降逆止嘔之功。研究認為，活血化瘀法有抗炎、免疫調節(jié)和保護神經(jīng)血管單元的功能[10]。

現(xiàn)代研究認為，神經(jīng)細胞中少突膠質細胞是神經(jīng)元髓鞘形成細胞，星形膠質細胞對神經(jīng)元結構起支撐和營養(yǎng)作用。此外，小膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)唯一的免疫細胞，可調節(jié)腦組織內免疫炎癥因子和營養(yǎng)物質表達，調節(jié)腦內環(huán)境及神經(jīng)細胞功能。GFAP是膠質細胞的骨架組成蛋白[11]，GFAP過度分泌會導致膠質瘢痕形成，影響神經(jīng)細胞的再生。MMP-9具有降解細胞外基質的作用[12]。實驗表明，腦震蕩后大鼠腦組織GFAP和MMP-9表達升高，且病理研究顯示，腦組織髓鞘存在明顯腫脹、排列紊亂，以及尼氏體數(shù)量減少，說明腦震蕩發(fā)生時存在神經(jīng)細胞結構的異常；腦震寧方可下調模型大鼠神經(jīng)元GFAP和MMP-9表達，改善髓鞘腫脹以及尼氏體數(shù)量減少的神經(jīng)損傷性病理變化，說明腦震寧方對腦震蕩后腦組織神經(jīng)元損傷修復和促進再生具有良性調節(jié)作用。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.吡拉西坦組；D.腦震寧小劑量組；E.腦震寧中劑量組；F.腦震寧大劑量組。圖3 6組大鼠腦組織GFAP、IL-6、iNOS、MMP-9細胞陽性的表達(×200)A.normal control group；B.model control group；C.piracetam group；D.Naozhenning low dose group；E.Naozhenning medium dose group；F.Naozhenning high dose group.Fig.3 Expression of GFAP，IL-6，iNOS and MMP-9 in brain tissues of six groups of rats( ×200)

星形膠質細胞和小膠質細胞不僅參與神經(jīng)元結構組成，二者還相互耦聯(lián)，參與腦組織內的免疫調節(jié)和炎癥反應。在腦組織發(fā)生缺血缺氧、感染或創(chuàng)傷時，神經(jīng)膠質細胞激活，其分泌神經(jīng)營養(yǎng)物質和免疫調節(jié)因子，以支持髓鞘蛋白合成，維護神經(jīng)元微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用被抑制；小膠質細胞則極化為具有刺激炎癥反應的M1型細胞，造成神經(jīng)元的功能異常和結構損傷[13]。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activeated protein kinase，MAPK)與炎癥反應等關系密切，ERK1/2通路是MAPK信號通路的主要組成通路之一。研究證實，炎癥反應可激活MAPK通路，并參與神經(jīng)性疾病的發(fā)生和發(fā)展[14]；同時，激活p38MAPK可直接轉錄調控星形膠質細胞中的iNOS和腫瘤壞死因子(TNF)-α等，導致慢性神經(jīng)炎癥。整合藥理學研究認為，MAPK通路為腦震寧干預腦震蕩的主要信號通路[15]，本課題組研究也發(fā)現(xiàn)，腦震蕩模型ERK表達異常升高，同時，腦組織內IL-6、iNOS表達也顯著升高。IL-6是炎癥反應的關鍵因子，其通過β鏈向腦組織各類細胞傳遞信息，誘導神經(jīng)元分化，參與腦組織炎癥反應[16]；iNOS在顱腦損傷過程中的高表達，使其與氧自由基結合生成強氧化劑，氧自由基清除物質谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶等降低[17]，造成氧化損傷性神經(jīng)毒性，在加重神經(jīng)炎癥反應的同時，造成神經(jīng)細胞腫脹和死亡[18]。

研究發(fā)現(xiàn)，ERK激活是MMP-9活化和過度表達的必要條件，且已證實抑制ERK對下調MMP-9表達有很好的作用，MAPK抑制劑P38可明顯減少MMP-9表達[19]。結合MAPK對神經(jīng)炎癥反應的促進作用，提示神經(jīng)MAPK通路可能通過神經(jīng)細胞內炎癥反應參與神經(jīng)細胞結構的改變。腦震寧方干預后，腦組織ERK及IL-6、iNOS均受到抑制，結合活血化瘀、養(yǎng)血之功效對抗炎及修復腦神經(jīng)損傷的作用，提示腦震寧方對腦組織神經(jīng)元的修復作用與其調節(jié)ERK信號通路，減輕炎癥反應有關。

綜上所述，腦震蕩發(fā)生可能通過ERK通路參與神經(jīng)炎癥反應，導致神經(jīng)細胞的過度增生、腫脹等。腦震寧方可抑制IL-6、iNOS及MMP-9、GFAP的表達，從而起到修復神經(jīng)元結構和功能的作用。腦震寧中劑量組與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，大劑量組較小劑量組的變化幅度更小，且差異無統(tǒng)計學意義，提示腦震寧劑量以中劑量組為佳；但是，各劑量組中，IL-6和MMP-9蛋白和基因相對表達量未完全一致，反映腦震寧方對腦震蕩的作用存在基因表達和蛋白表達的不同步性，今后可進一步進行免疫印跡分析，對蛋白和蛋白磷酸化進行定量，從功能激活角度對腦震寧方的有效劑量進行深入探索。