付 佳， 荀晨曦， 李 爽， 官 杰

抑郁癥作為精神科常見疾病之一，是一種以持久的低落心態(tài)為主的情感綜合障礙。目前西藥是治療的首選，但服藥持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)[1-3]。近年來，臨床研究也證實(shí)了以中藥為基礎(chǔ)的治療方案對(duì)抑郁癥的有效性[4]。石菖蒲主要含有揮發(fā)油、氨基酸、有機(jī)酸和糖等成分，具有暖胃祛濕等功效，可用于治療腦部疾病，抗抑郁作用效果明顯，但目前對(duì)其具體機(jī)制尚不明確[5]。本研究觀察不同劑量石菖蒲干預(yù)對(duì)抑郁大鼠的行為表現(xiàn)及神經(jīng)遞質(zhì)變化情況，探討石菖蒲抗抑郁作用的機(jī)制，為新型抗抑郁藥物的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取同批次健康成年雄性SD大鼠30只，體重180～220 g，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(黑)2018-017]。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 石菖蒲中藥原料購(gòu)自齊齊哈爾醫(yī)藥商廈。石菖蒲水提取液制備：將石菖蒲與同等質(zhì)量的水進(jìn)行熬制30 min，過濾。鹽酸氟西汀分散片(禮來蘇州制藥有限公司，批號(hào)8376A)。生理鹽水購(gòu)自東莞市悅潤(rùn)生物科技有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 抑郁大鼠造模[6-9]將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、氟西汀組、石菖蒲低劑量組、石菖蒲中劑量組和石菖蒲高劑量組，每組5只，單獨(dú)飼養(yǎng)。除空白組外，其余5組予以慢性、不可預(yù)見的溫和刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)，持續(xù)干預(yù)21 d，包括以下6種刺激：(1)禁食、禁水20 h；(2)傾斜鼠籠(45°)17 h；(3)濕籠，將大鼠浸入含有100 g鋸屑、200 ml水的籠中21 h；(4)4 ℃游泳5 min；(5)水平搖晃鼠籠5 min；(6)限制行為，把大鼠放入自制的束縛器中4 h。每天隨機(jī)予以其中一種刺激。以上刺激實(shí)驗(yàn)以不影響大鼠正常晝夜活動(dòng)節(jié)律、使大鼠無損傷為前提，以不產(chǎn)生壓迫感、不影響呼吸和排泄為度。最終以強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)(forced swimming test,FST)、曠場(chǎng)試驗(yàn)(open field test,OFT)、高架十字迷宮試驗(yàn)(elevated plus-maze test,EPM)等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)滿足大鼠抑郁表現(xiàn)判定大鼠抑郁造模成功。期間無大鼠死亡。

1.3.2 藥物干預(yù)方法[10]于每天CUMS干預(yù)1 h后予以藥物干預(yù)。石菖蒲低劑量組、石菖蒲中劑量組和石菖蒲高劑量組分別予以5 ml/(kg·d)、10 ml/(kg·d)和20 ml/(kg·d)石菖蒲水提取液灌胃。氟西汀組予以1.8 mg/(kg·d)氟西汀水溶液灌胃?？瞻捉M和模型組予以10 ml/(kg·d)生理鹽水灌胃。各組藥物干預(yù)均為1次/d,連續(xù)干預(yù)21 d。

1.4行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.4.1 OFT[11-12]于大鼠抑郁模型建立21 d后進(jìn)行OFT。實(shí)驗(yàn)裝置是一個(gè)開放的空間(100 cm×100 cm×40 cm)，四壁黑色。將大鼠置于開放室中央，以大鼠5 min內(nèi)穿過廣場(chǎng)的次數(shù)記作水平活動(dòng)分?jǐn)?shù)，以大鼠5 min內(nèi)前肢離地的次數(shù)記作垂直活動(dòng)分?jǐn)?shù)。水平分?jǐn)?shù)與垂直分?jǐn)?shù)之和即為OFT得分。

1.4.2 FST[13-14]于OFT結(jié)束3 d后進(jìn)行FST。將安靜狀態(tài)下的大鼠放入已經(jīng)連接好的圓柱水缸中，強(qiáng)迫其在25 ℃的水中持續(xù)游泳15 min。結(jié)束后，用毛巾擦干大鼠鼠毛，必要時(shí)用吹風(fēng)機(jī)吹干，放回鼠籠。24 h后，再次將大鼠置入水缸中5 min，記錄5 min內(nèi)大鼠的不動(dòng)時(shí)間(單位：s)。

1.4.3 EPM[15]于FST結(jié)束3 d后進(jìn)行EPM。將大鼠放入中央平臺(tái)(面朝閉合臂)，5 min后記錄各項(xiàng)指標(biāo)：開放臂停留時(shí)間(open-arm time,OT)、閉合臂停留時(shí)間(close-arm time，CT)。兩臂停留總時(shí)間(total time，TT)=OT+CT。本研究以O(shè)T/TT作為EPM結(jié)果進(jìn)行記錄。

1.5神經(jīng)遞質(zhì)水平檢測(cè)[16]在完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后將大鼠斷頭處死，在冰上剝離全腦，取前額葉、海馬組織和紋狀體，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈置于EP管。分別向組織加入適量的生理鹽水搗碎，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，-80℃保存?zhèn)錂z。檢測(cè)時(shí)室溫解凍，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法進(jìn)行多巴胺(dopamine,DA)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自廈門慧嘉生物科技有限公司。操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 模型組游泳不動(dòng)時(shí)間高于空白組，OFT得分、OT/TT低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示大鼠抑郁模型建立成功。隨著石菖蒲劑量的升高，大鼠OFT得分、OT/TT呈上升趨勢(shì)，游泳不動(dòng)時(shí)間呈下降趨勢(shì)，石菖蒲高、中、低劑量組與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。石菖蒲高劑量組OFT得分、游泳不動(dòng)時(shí)間、OT/TT與氟西汀組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.2各組大鼠腦組織DA、5-HT比較 模型組腦組織DA、5-HT水平均低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著石菖蒲劑量的升高，大鼠腦組織DA、5-HT水平均呈上升趨勢(shì)。石菖蒲高劑量組和氟西汀組腦組織DA、5-HT水平均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。石菖蒲高劑量組和氟西汀組腦組織DA、5-HT水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腦組織DA、5-HT比較

3 討論

3.1目前，抑郁癥作為僅次于缺血心肌病的第二大疾病，其患病人數(shù)仍逐年增長(zhǎng)，且有年輕化的趨勢(shì)。我國(guó)古代典籍就有對(duì)抑郁癥的描述。中醫(yī)認(rèn)為，郁證是由于肝氣過旺，或體質(zhì)平素太弱，加之情志因素所致氣機(jī)不暢，肝氣失于疏泄，脾失健運(yùn)，心失所養(yǎng)，臟腑陰陽氣血失調(diào)而成。隨著對(duì)郁證論治理論的深入研究，中醫(yī)藥對(duì)情志疾病特別是郁證的治療及預(yù)防將顯示出其優(yōu)勢(shì)[17-20]。中藥石菖蒲其根莖葉的提取物中含有抗抑郁物質(zhì)，能夠有效改善抑郁癥狀，但目前對(duì)其機(jī)理研究甚少。

3.2單胺類神經(jīng)遞質(zhì)有廣泛的生物學(xué)功能，參與睡眠節(jié)律調(diào)節(jié)、精神活動(dòng)、體溫調(diào)控、情緒反應(yīng)等生理反應(yīng)。神經(jīng)遞質(zhì)由神經(jīng)末梢釋放以完成神經(jīng)元之間信息傳遞，對(duì)神經(jīng)、內(nèi)分泌等相關(guān)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。目前認(rèn)為與抑郁癥發(fā)病相關(guān)較為密切的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)有5-HT、DA、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)等[21-22]。5-HT在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展中有重要地位。有研究表明，5-HT水平與抑郁癥的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[23]。對(duì)抑郁癥患者的尸檢也發(fā)現(xiàn)，其縫核內(nèi)5-HT含量明顯減少[24]。目前，在臨床上使用的抗抑郁藥物也是通過抑制5-HT的代謝和重?cái)z取以提升5-HT含量，從而起到抗抑郁的作用[25]。另外，DA的減少與抑郁癥也有緊密聯(lián)系[26]?；加心承┠芤饳C(jī)體DA水平降低疾病的患者，常常表現(xiàn)出抑郁的情緒[27]。因此，在眾多抑郁癥病因的假說中，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說得到較廣泛的認(rèn)可，這也是目前臨床抗抑郁治療的基礎(chǔ)。該假說認(rèn)為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的5-HT能神經(jīng)和DA能神經(jīng)存在著復(fù)雜的聯(lián)系，腦組織內(nèi)DA和5-HT缺乏是引起抑郁的重要原因之一[28]。

3.3本研究通過CUMS建立抑郁大鼠模型，并通過FST、OFT、EPM行為學(xué)實(shí)驗(yàn)判定造模成功。OFT可反映大鼠進(jìn)入新環(huán)境的活動(dòng)情況和情緒變化，觀察其出現(xiàn)與抑郁癥患者類似的運(yùn)動(dòng)遲緩、精神萎靡、缺乏興趣等癥狀的情況。FST可反映大鼠在行為絕望時(shí)的自主反應(yīng)，觀察其出現(xiàn)與抑郁癥患者類似的輕生厭世、求生欲降低等麻木情緒的情況。臨床上抑郁和焦慮是密切關(guān)聯(lián)的癥狀，而EPM可反映大鼠的焦慮表現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的游泳不動(dòng)時(shí)間顯著高于空白組，OFT得分、OT/TT顯著低于空白組，提示抑郁大鼠模型建造成功。而經(jīng)過不同劑量的石菖蒲干預(yù)后，抑郁大鼠的行為學(xué)指標(biāo)獲得改善，提示抑郁癥狀好轉(zhuǎn)，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)出劑量依賴性。另外，本研究結(jié)果還顯示，抑郁大鼠腦組織的DA、5-HT水平顯著低于空白組，這也驗(yàn)證了DA和5-HT在抑郁癥發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。經(jīng)過不同劑量石菖蒲干預(yù)后，抑郁大鼠腦組織的DA、5-HT水平上升，且呈劑量依賴性。

綜上所述，抑郁癥的發(fā)生可能與腦組織DA、5-HT水平、功能下降有關(guān)，石菖蒲治療可有效改善抑郁癥狀，且這可能是通過提升大腦環(huán)境中DA、5-HT含量實(shí)現(xiàn)的。