文劉方， 唐 俏， 王心維， 陳 潔， 陳 秀， 韋吳迪， 陳榮鳳， 梁 浩， 蔣俊俊

馬爾尼菲籃狀菌(Talaromyces marneffei，TM)是主要流行于東南亞[1]和中國南部[2-3]的地方性條件致病菌。它屬于溫度雙相的機會性感染真菌，酵母相是其致病的主要形態(tài)。TM常見的感染途徑是呼吸道吸入孢子，隨后在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榻湍赶嗳胙獙?dǎo)致馬爾尼菲籃狀菌病[4]。TM感染潛伏期長，無特異癥狀，病死率較高[5]。雖然抗真菌藥物可以獲得不錯的治療效果[2]，但并不能完全清除潛伏狀態(tài)下的TM。瘦素(leptin)是一種由白色脂肪細胞分泌的多效蛋白質(zhì)[6]，可作為細胞因子參與先天免疫反應(yīng)，例如促進單核/巨噬細胞的吞噬功能和促炎細胞因子的釋放[7]。巨噬細胞是TM感染的主要靶細胞，其表面存在多種模式識別受體，其中包括經(jīng)典的Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)。有研究顯示，TM感染與巨噬細胞上的TLRs相關(guān)[8]，TLRs單克隆抗體可抑制分生孢子生長，且這一效應(yīng)具有劑量依賴性[9]。研究發(fā)現(xiàn)，TLRs家族的TLR 1-9[10]以及TLR 11-13[11]都呈現(xiàn)出瘦素濃度依賴性。此外，瘦素也與多種病原體感染具有關(guān)聯(lián)[12]，故推測瘦素可能具有抑制巨噬細胞中TM增殖的作用，并可能通過TLRs信號通路引起炎癥因子變化而發(fā)揮作用。本研究就瘦素抑制巨噬細胞中TM增殖的影響及機制進行探討，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1主要材料及試劑 THP-1細胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細胞庫。TM為由本實驗室從患者血液中分離后經(jīng)形態(tài)學(xué)和測序比對鑒定后建立的菌株。瘦素購自PeproTech公司。佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)購自美國Sigma公司。Trizol Reagent購自賽默飛(美國)公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑(Takara Prime ScriptTM RT Master Mix-RR036A)和實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction)試劑(Takara SYBR Premix Ex Taq TM II-RR820A)購自大連寶生物工程有限公司。引物由生工生物工程(上海)公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2主要實驗儀器 恒宇生化培養(yǎng)箱(SPX-250-II)，37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱(E-014)，賽默飛世爾高速冷凍離心機(ST16R)，Bio Tek多功能酶標(biāo)儀(Synergy H1)，凝膠成像儀，ABI熒光定量PCR系統(tǒng)(Step One Plus)。

1.3實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 37 ℃水浴復(fù)蘇液氮凍存的THP-1細胞，按10%胎牛血清、1%青鏈霉素(100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素)、89% 1640培養(yǎng)液比例混合配置完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱條件設(shè)置為5% CO2，37 ℃。

1.3.2 CCK-8法檢測瘦素的細胞增殖毒性 取生長對數(shù)期的THP-1細胞以5×104cells/孔接種于96孔板，總體積100 μl，共4塊板。加入PMA(終濃度為50 ng/ml)刺激貼壁，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 d，誘導(dǎo)分化為巨噬細胞。2 d后更換培養(yǎng)液，并向培養(yǎng)板中加入10 μl瘦素，濃度分別為0.5 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml，每個濃度重復(fù)3孔，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。每塊板分別在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后加入10 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h。應(yīng)用酶標(biāo)儀測定其在450 nm處的吸光度，根據(jù)試劑盒說明書計算細胞活性，以細胞活性≥80%認為該濃度下瘦素對細胞增殖影響較小。

1.3.3 菌落形成單位(colony forming unit，CFU)實驗評估THP-1巨噬細胞中TM的增殖情況 取生長對數(shù)期的THP-1細胞25×104cells/孔接種至24孔板，加入PMA(終濃度為50 ng/ml)刺激貼壁，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 d，誘導(dǎo)分化為巨噬細胞。以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=5加入TM，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)輕柔清洗兩遍，洗去未被吞噬的孢子。實驗組中加入不同終濃度瘦素(0.5 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、15 μg/ml)，對照組加入等體積不含瘦素的完全培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個重復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄去孔內(nèi)上清液，以PBS輕柔洗滌兩遍，加入純凈水漲破細胞收集TM。14 000 g 4 ℃離心10 min，棄上清，加入1 ml H2O進行重懸，在稀釋10倍、100倍和1 000倍后取5 μl滴加到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，27 ℃條件培養(yǎng)3 d，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照計數(shù)。

1.3.4 實時熒光定量PCR檢測TLR信號通路的mRNA表達水平 取對數(shù)生長期的THP-1細胞接種至24孔板，25×104cells/孔，加入PMA(終濃度為50 ng/ml)刺激貼壁，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 d，誘導(dǎo)分化為巨噬細胞。以MOI=5加入TM，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入PBS輕柔清洗兩遍。實驗組加入含有瘦素的完全培養(yǎng)液(瘦素終濃度為5 μg/ml)，對照組加入不含瘦素的完全培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個重復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄去孔內(nèi)上清液，采用Trizol法提取細胞總RNA，檢測RNA濃度和純度合格后通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，以cDNA為模板通過實時熒光定量PCR檢測TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、TLR7、髓樣分化原發(fā)反應(yīng)基因88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、促分裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、巨噬細胞炎癥蛋白1α(macrophage inflammatory protein 1α,MIP-1α)、白介素(interleukin，IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α的mRNA表達情況。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算相對表達量。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用Graphpad 8.0進行繪圖和統(tǒng)計分析，計量資料的組間比較采用成組t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各干預(yù)組細胞活性情況 CCK-8實驗結(jié)果顯示，經(jīng)0.5～20 μg/ml終濃度瘦素干預(yù)24 h和48 h，THP-1巨噬細胞活性>80%，提示該條件下瘦素未對THP-1巨噬細胞產(chǎn)生毒性影響，可用于后續(xù)實驗。見圖1。

圖1 各干預(yù)組細胞活性情況圖

2.2各干預(yù)組THP-1巨噬細胞中TM增殖情況比較 CFU實驗結(jié)果顯示，除終濃度為0.5 μg/ml外，終濃度為1～15 μg/ml瘦素均可有效抑制THP-1巨噬細胞中TM的增殖(P<0.05)，且在終濃度為5 μg/ml時即可獲得最佳的抑制效應(yīng)。見圖2。

?各干預(yù)組CFU比較；? 5 μg/ml瘦素干預(yù)下的CFU實驗滴板圖

2.3各干預(yù)組TLRs mRNA表達水平比較 實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，實驗組TLR2、TLR6 mRNA表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但兩組TLR3、TLR4、TLR7 mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

2.4各干預(yù)組TLRs信號下游因子mRNA表達水平比較 熒光定量PCR結(jié)果顯示，實驗組MyD88、MAPK1、IL-1β mRNA表達水平高于對照組，IL-6 mRNA表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而兩組TNF-α和MIP-1α mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖3 各干預(yù)組TLRs mRNA表達水平比較圖

圖4 各干預(yù)組TLRs信號下游因子mRNA表達水平比較圖

3 討論

3.1TM是一種機會感染性病原體，其可感染機體中的巨噬細胞，同時巨噬細胞也可將其吞噬和殺滅，但仍有部分TM出現(xiàn)免疫逃逸，導(dǎo)致病情往復(fù)[13-14]。瘦素是人體脂肪組織產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)，研究顯示其具有調(diào)節(jié)TNF-α表達和激活巨噬細胞的功能[15]。但目前關(guān)于瘦素能否抑制巨噬細胞中TM的增殖，或增強巨噬細胞吞噬、消滅TM的能力仍鮮有報道。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)瘦素處理后，THP-1巨噬細胞中TM的增殖減弱，這與既往研究[12，16]認為較高濃度的瘦素可拮抗多種病原體感染的結(jié)論相符。

3.2TLRs是巨噬細胞識別TM的主要模式識別受體之一，通過與病原體相關(guān)分子模式結(jié)合，從而激活免疫系統(tǒng)。本研究結(jié)果顯示，實驗組TLR2、TLR6 mRNA表達水平顯著上升，但對TLR3、TLR4、TLR7影響不大，提示瘦素可能是通過上調(diào)巨噬細胞TLR2、TLR6表達來抑制TM的增殖。Wang等[17]的研究對TLR2、TLR4和TLR9基因中可能影響TM易感性的單核苷酸多態(tài)性進行了探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR2中存在與TM感染疾病嚴重程度相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點，提示TLR2與TM感染具有關(guān)聯(lián)性。另外也有研究發(fā)現(xiàn)，TLR2和TLR6通過識別白色念珠菌細胞壁上的酵母多糖和登革熱病毒配體在抗病毒和抗真菌上發(fā)揮著關(guān)鍵作用[18-19]。登革熱病毒感染人單核細胞后可通過激活TLR2和TLR6通路上調(diào)促炎因子的表達，這與本研究結(jié)果相似。

3.3本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)瘦素干預(yù)后THP-1巨噬細胞TLRs下游因子MyD88、MAPK1 mRNA表達上升。TLRs同源分子都屬于Ⅰ型跨膜蛋白，當(dāng)TLRs被激活時就會募集MyD88、含TIR結(jié)構(gòu)域的銜接子蛋白(TIR domain-containing adaptor protein,TIRAP)等銜接分子，通過MyD88依賴性或MyD88非依賴性途徑發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，激活MAPK和(或)核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路后級聯(lián)上調(diào)促炎因子的表達[20-21]，這與我們的實驗結(jié)果相符。另外，本研究結(jié)果還顯示，經(jīng)瘦素干預(yù)后THP-1巨噬細胞IL-1β mRNA的表達顯著上升，而IL-6 mRNA表達顯著下降。IL-1β和IL-6同屬于炎癥因子家族。IL-1β屬于IL-1家族中的關(guān)鍵促炎因子之一[22]，其表達升高有利于病毒[23]、真菌[24]等病原體的清除，這與本研究發(fā)現(xiàn)瘦素可以促進THP-1巨噬細胞殺滅TM相符。而IL-6具有抗炎和促炎兩種特性，在經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中它發(fā)揮抑炎作用，而在非經(jīng)典的反式信號通路中則表現(xiàn)出促炎活性[25]。有研究發(fā)現(xiàn)TM感染后IL-6表達下降[26]，且高水平IL-6會促進TM感染病情惡化[27]。也有臨床研究結(jié)果顯示，人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染患者合并TM感染后IL-6水平上升[28]，與本研究結(jié)果有所差異，這可能是感染HIV所造成的影響。因此，本研究結(jié)果提示瘦素促進THP-1巨噬細胞殺滅TM可能是通過MyD88依賴性激活MAPK1通路，并上調(diào)促炎因子IL-1β和下調(diào)抑炎因子IL-6發(fā)揮作用。

綜上所述，瘦素可促進THP-1巨噬細胞殺滅TM，這可能是通過上調(diào)TLR2/6-MyD88-MAPK1信號通路，激活炎癥因子發(fā)揮作用。但本研究僅是針對mRNA水平進行，后期尚需要補充蛋白水平和動物實驗進一步驗證。