尚家澄，吳麗紅，馬思揚，邵 楠

(遼寧科技學(xué)院 生物醫(yī)藥與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 本溪117002)

近年來，隨著人們對天然藥物療效認(rèn)識程度的提高，中藥制藥行業(yè)得到了迅猛發(fā)展，隨之大量的中藥生產(chǎn)廢水需要處理。中藥廢水有機污染物濃度高，根據(jù)中藥原材料及生產(chǎn)工藝不同，其廢水成分復(fù)雜且水質(zhì)水量變化較大，廢水的可生化性較好。目前，我國關(guān)于中藥廢水的處理技術(shù)報道得不多，許多研究停留于實驗室小試階段〔1-2〕。

中藥廢水的基本處理方法分三類：物化法、生物法和物化-生物法〔3〕。用物化法處理中藥廢水的成本高，勞動強度大，極易引起二次污染，是一種高投入低產(chǎn)出的方法。生物處理方法就是利用微生物的新陳代謝功能，使廢水中呈溶解和膠體狀態(tài)的有機污染物被降解并轉(zhuǎn)化為無害的物質(zhì)，使廢水得以凈化。常用的生物處理方法有厭氧生物處理工藝、好氧生物處理工藝、厭氧-好氧工藝和水解(酸化)-好氧工藝等。物化-生物處理法是以生物處理法為主體處理工藝，物化處理法為預(yù)處理或后處理的工藝。

在現(xiàn)有污水處理系統(tǒng)基礎(chǔ)上結(jié)合生物強化技術(shù)向廢水處理系統(tǒng)中投加功能微生物菌劑，可以進一步提高難降解有機污染物的處理效率〔4-5〕，獲得用于投加系統(tǒng)的高效菌種是進行生物強化技術(shù)的關(guān)鍵點〔6〕，菌種可以是單一菌種也可以是復(fù)合菌種，可以從污水處理系統(tǒng)中篩選獲得，也可以外源添加，最終目的是提高系統(tǒng)的污染物處理能力。

為了提高中藥廢水的處理效果，本試驗針對中藥廢水的特點在傳統(tǒng)單一生物處理工藝基礎(chǔ)上開發(fā)了一體化廢水處理裝置(水解酸化+接觸氧化+BAF)，本試驗從穩(wěn)定運行的處理中藥廢水的一體化裝置水解酸化段和接觸氧化段定向分離篩選功能菌，以CODcr為考察指標(biāo)，通過對CODcr的處理能力考察目的功能菌對高濃度中藥廢水的降解效果，獲得中藥廢水處理高效菌種，以便為生物強化處理中藥廢水提供菌源，從而在實際工藝中達(dá)到快速啟動反應(yīng)器，縮短污泥適應(yīng)期，進而在工藝運行過程中獲得高效穩(wěn)定的運行效果。

1 試驗方法

1.1 菌種來源

本試驗過程中分離篩選菌種來源于穩(wěn)定運行的中藥廢水處理一體化處理裝置(水解酸化+接觸氧化+BAF)的水解酸化段和接觸氧化段，該裝置水解酸化段是將廢水中難降解大分子有機物轉(zhuǎn)化為小分子有機物，利于后續(xù)工藝中微生物對有機物的降解與轉(zhuǎn)化；生物接觸氧化池屬于生物膜法去除系統(tǒng)中的有機物，并具有反硝化脫氮作用；曝氣生物濾池(BAF)集生物接觸氧化與懸浮物濾床截留功能于一體，可有效去除水中的懸浮物、氨氮、有機物。實際運行過程中，裝置對中藥廢水(1∶1稀釋)COD有較好的去除效果，但還達(dá)不到直接處理原水(COD在6 000 mg/L～8 000 mg/L范圍內(nèi))的能力，所以結(jié)合生物強化法可以進一步提高系統(tǒng)的污染物去除效果，以達(dá)到直接處理原水達(dá)標(biāo)排放的目的。

本試驗取一體化處理裝置的水解酸化段和接觸氧化段活性污泥混合液進行高濃度COD降解功能菌的篩選。

1.2 中藥廢水原水水質(zhì)

工藝運行所用的中藥廢水取自遼寧省本溪市藥都某中藥廠。原水水質(zhì)隨生產(chǎn)周期有一定的波動性，COD：6 000 mg/L～8 000 mg/L，BOD5：2 500 mg/L～4 000 mg/L，氨氮：20 mg/L～30 mg/L，pH值7～9。COD采用COD快速測定儀測定，BOD5采用五日培養(yǎng)法。

1.3 COD降解菌的分離、純化與篩選

1.3.1 培養(yǎng)基〔7〕

(1)富集培養(yǎng)基(葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基)：6.0 g葡萄糖，2.0 g蛋白胨，1.0 g KH2PO4，1.0 g MgSO4·7H2O，1 000 mL蒸餾水pH值7.2～7.5，121 ℃高壓滅菌20 min。

(2)馴化選擇培養(yǎng)基：3.0 g(NH4)2SO4，0.5 g Na2HPO4，0.5 g KH2PO4，0.2 g MgSO4·7H2O，微量元素1 mL，pH值7.2～7.5，1 000 mL水(中藥廢水比例按梯度馴化逐漸提高，直到與原污水濃度相同為止)，121 ℃高壓滅菌20 min。其中微量元素：0.5 g FeSO4·7H2O，0.2 g CaCl2·2H2O，0.15 g MnSO4·7H2O，0.15 g ZnSO4，1 000 mL蒸餾水。

(3)菌種分離培養(yǎng)基：在馴化培養(yǎng)基中加入15 g-20 g瓊脂，用中藥廢水代替蒸餾水，其他條件與馴化選擇培養(yǎng)基相同。

馴化培養(yǎng)基與菌種分離培養(yǎng)基中均不外加碳源，碳源完全由中藥廢水中的有機物提供。

1.3.2 菌種培養(yǎng)

(1)富集培養(yǎng)：分別取水解酸化段和接觸氧化段活性污泥混合液5 mL，接入葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在30 ℃，120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，72 h為一個周期，如此反復(fù)富集三個周期。

(2)定向選擇馴化培養(yǎng)：將50 mL在1.3.2(1)條件下富集混合菌液接種在1.3.1(2)培養(yǎng)液中，不添加其他外加碳源，以中藥廢水為唯一碳源進行恒溫?fù)u床培養(yǎng)，中藥廢水初始添加量為培養(yǎng)液的20%，定時取樣測定培養(yǎng)液菌濁(A600 nm)的變化情況。培養(yǎng)基明顯渾濁后，表明菌種適應(yīng)中藥廢水中有機物的種類與濃度，即可將混合菌液轉(zhuǎn)接于新鮮選擇培養(yǎng)基中，并逐步增加中藥廢水的比例，中藥廢水比例以20%遞增，直到中藥廢水原水濃度相同為止。在馴化過程中，能適應(yīng)該中藥廢水環(huán)境的菌體得以生存且耐受力逐漸得到加強，成為優(yōu)勢菌，其他菌體則被淘汰。

1.3.3 菌種分離

菌種分離取選擇馴化培養(yǎng)時中藥廢水最高濃度的混合菌培養(yǎng)液作為菌源，用中藥廢水原水配制的固體選擇培養(yǎng)基進行高效有機物降解目的菌種的分離，無菌條件下通過平板劃線法反復(fù)分離純化(混合細(xì)菌平板培養(yǎng)—單菌落分離、純化培養(yǎng))。

1.3.4 菌種篩選

將在1.3.3過程中分離得到的不同純菌進行擴大培養(yǎng)，然后用高速冷凍離心機進行離心處理，用無菌水將離心物洗出制備不同菌種的純菌液。純菌液有效活菌數(shù)約為108CFU/mL～109CFU/mL，取等量純菌液接種到裝有200 mL中藥廢水(測定COD為6 500 mg/L)的培養(yǎng)瓶進行搖床培養(yǎng)，每間隔一定的時間測定培養(yǎng)液COD濃度，根據(jù)不同純菌種對中藥廢水COD的降解能力篩選高效菌種。

1.3.5 優(yōu)選菌種的保藏

以無菌接種環(huán)挑取篩選得到的單菌落接種到滅菌試管斜面上，30 ℃恒溫培養(yǎng)至菌落長出。置冰箱保存?zhèn)溆?，用于后續(xù)菌種相關(guān)特性研究及生物強化擴大培養(yǎng)時使用。

1.3.6 功能菌株相關(guān)特性研究

對篩選出的高效菌株進行其單一菌種相關(guān)特性研究，進行形態(tài)觀察及生理生化試驗〔7〕。固體培養(yǎng)特征主要考察了菌體形態(tài)、菌落形狀、菌落隆起形狀、菌落邊緣形狀、菌落顏色、菌落透明程度、菌落黏稠度等。染色實驗主要進行了革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色、鞭毛染色等、生理生化實驗進行了需養(yǎng)性試驗、葡萄糖發(fā)酵實驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 富集培養(yǎng)

富集培養(yǎng)是在適于目標(biāo)微生物生長的條件下培養(yǎng)，目標(biāo)微生物將成為優(yōu)勢種而大量生長從而得到純培養(yǎng)的一種微生物培養(yǎng)方法。經(jīng)富集培養(yǎng)后會有大量的目標(biāo)微生物增殖，但其他非目標(biāo)微生物也會大量增殖，所以經(jīng)富集培養(yǎng)后迅速得到渾濁度雜菌培養(yǎng)液。

2.2 梯度選擇培養(yǎng)

選擇培養(yǎng)具有只允許特定的微生物生長，而同時抑制或阻止其他微生物生長的功能。中藥廢水中的高濃度有機污染物會抑制普通微生物的生長，而保留對難降解有機物具有降解或耐受能力的菌種。為了分離出對能夠高效降解高濃度有機物的功能菌，通過定向馴化培養(yǎng)增強菌種的降解性能。

在中藥廢水比例為20%，即COD濃度為1 000 mg/L～1 500 mg/L范圍內(nèi)培養(yǎng)液迅速渾濁，12 h即可觀察到培養(yǎng)液明顯渾濁，說明在該有機物濃度下菌種生長良好，菌種對該濃度的有機污染物具有良好的降解能力；當(dāng)中藥廢水比例為40%，即COD濃度為2 000 mg/L～3 000 mg/L范圍內(nèi)，菌種比上一梯度時生長適應(yīng)期稍變長，大概經(jīng)過約20 h后菌濁明顯增加，菌種生長良好，說明菌種在適應(yīng)該有機物濃度范圍后也有較好的降解效果；在后續(xù)提高中藥廢水比例的過程中，培養(yǎng)基開始變渾濁的初始時間越來越長，但后期菌種均有一定的生長，表明隨中藥廢水比例的提高，COD濃度升高，能適應(yīng)高濃度有機物的微生物種類越來越少，菌株生長均受到不同程度的抑制，但在高濃度中藥廢水中也有相應(yīng)的菌種適應(yīng)環(huán)境，具有一定的污染物降解能力。本試驗過程中，當(dāng)廢水濃度提高到與原中藥廢水相同，即不需稀釋時，經(jīng)36 h后，菌濁度也有明顯提高，表明在該濃度下，微生物能夠生存并降解污染物。理論上，此時由于高降解能力和耐受性的菌種種類和數(shù)量上均有所減少。

2.3 功能菌分離篩選及其降解效果

在菌種分離固體培養(yǎng)基平板上多次劃線，獲得19株純菌，根據(jù)菌株外觀典型性及對中藥廢水的去除效果，最終有9株菌具有較強的有機物降解能力，其中從水解酸化段篩選出5株，分別取代號為sj1、sj2、sj3、sj4、sj5；從接觸氧化池段篩選出4株，分別取代號為jc1、jc2、jc3、jc4。實驗結(jié)果如圖1、圖2。

在中藥廢水COD濃度均為6 500 mg/L條件下，培養(yǎng)1 d后，各菌株對有機物的去除雖有差異，但均有較好的去除效果，隨著培養(yǎng)時間的延長，COD濃度進一步降低，最終9株菌的COD去除率均在85%以上。除sj2、sj5、jc1外，其他5種菌4 d后COD降解基本達(dá)到最高，第五天測定結(jié)果沒有明顯變化，最終COD去除率sj1為87.2%、sj3為89.9%、sj4為87.2%、jc2為85.3%、jc3為88%、jc4為87.7%。而菌株sj2、sj5、jc1第5 d對COD仍有很好的去除，最終COD去除率分別為97.8%、96.1%和97.3%，對高濃度中藥廢水有很強的去除效果。兩株水解酸化菌sj2、sj5還有個共同特點，即一天后并不是9株功能菌中降解有機物速度最快的，但降解效果持久，最終COD去除效果好。

可以看出，由于中藥廢水進水濃度高，雖然功能菌的COD去除率都較高，即便是去除率最高的sj2，COD去除率達(dá)到97.8%，但其出水COD值仍達(dá)140 mg/L左右。所以在廢水處理實際工藝中水解酸化段必須配合其他好氧工藝才能使出水達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)。在本實驗實際運行中，一體化處理裝置接觸氧化段的進水為水解酸化段的出水，進水COD較原水已有明顯降低，如果采用生物強化技術(shù)將從水解酸化段和接觸氧化段分離出的高效功能菌擴大培養(yǎng)后分別應(yīng)用于一體化處理裝置的對應(yīng)處理段，應(yīng)具有很好的出水效果，甚至有可能解放曝氣生物濾池(BAF)段，這樣可以大大減少成本與工藝整體運行時間。

2.4 功能菌形態(tài)觀察及生理生化試驗

對篩選出的9菌株進行了形態(tài)觀察及生理生化試驗，結(jié)果見表1。

表1 不同菌株形態(tài)特征及其生理生化試驗結(jié)果

根據(jù)實驗結(jié)果，查閱微生物鑒定手冊初步判斷篩選到的9株具有高濃度有機物降解性能的菌種8株為細(xì)菌，1株為霉菌，具體微生物學(xué)類別還需進一步研究后確定。

3 結(jié)論

(1)從穩(wěn)定運行的一體化裝置水解酸化段篩選出5株高效COD降解功能菌，接觸氧化段篩選出4株高效COD降解功能菌。在進水中藥廢水COD濃度為6 500 mg/L條件下進行菌種的污染物降解試驗，該9株微生物對COD的去除率均在85%以上，其中菌株sj2、sj5、jc1 COD降解率分別約為97.8%、96.1%和97.3%，體現(xiàn)出了很強的高濃度有機物降解能力。

(2)對9株菌株進行了形態(tài)觀察及生理生化試驗，判斷8株為細(xì)菌，1株為霉菌，說明真菌在高濃度有機物降解中也有很好的去除效果。在后續(xù)工作中應(yīng)進一步通過分子生物學(xué)手段鑒定菌種，同時考察優(yōu)勢菌的有機物降解特性，為生物強化處理高濃度中藥廢水提供參數(shù)。

(3)在后續(xù)采用生物強化法處理中藥廢水時，可以按水解酸化段和接觸氧化段分別強化運行，不同菌種有針對性地分別投入不同工藝段會有更好的應(yīng)用性。