王惠 ，王書建 ，卞漢中 ，謝國興 ，周陽 *

（1.鹽城市大豐區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江蘇 鹽城 224100；2.鹽城市大豐區(qū)劉莊鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，江蘇 鹽城 224100；3.鹽城市大豐區(qū)葦魚養(yǎng)殖場，江蘇 鹽城 224100）

草魚（Ctenopharyngodon idellus）是我國淡水魚類中的四大家魚之一，2017 年產(chǎn)量超過580 萬t，是世界水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中產(chǎn)量較大的魚類[1]，對我國的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)有卓越的貢獻(xiàn)。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，細(xì)菌性出血病對草魚的危害較為嚴(yán)重。目前引起草魚出血病的細(xì)菌有嗜水氣單胞菌[2]、維氏氣單胞菌[3]、魯氏耶爾森菌[4]等，而創(chuàng)傷弧菌感染草魚的案例曾于2019 年在天津養(yǎng)殖場被首次報(bào)道[5]。這些細(xì)菌均容易感染草魚，引起暴發(fā)性出血病，導(dǎo)致死亡，給草魚養(yǎng)殖者帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

2020 年4 月中旬，鹽城市大豐區(qū)某養(yǎng)殖場出現(xiàn)草魚大量死亡現(xiàn)象，該研究對養(yǎng)殖場內(nèi)的具有典型癥狀的發(fā)病草魚進(jìn)行了魚體解剖和實(shí)驗(yàn)室診斷，從瀕臨死亡的草魚體內(nèi)分離純化出一株優(yōu)勢菌株，通過16S rDNA 分析進(jìn)行菌種鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示為鰻弧菌，這在草魚的細(xì)菌性疾病研究中鮮有報(bào)道。同時對該菌株進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 病理樣本

發(fā)病草魚取自大豐某塘口，體質(zhì)量為412 g，體長25.2 cm。典型癥狀為眼球突出，眼眶周圍充血，尾鰭發(fā)白，頭部、鰭肢末梢和鱗片體表有大量的血，見圖 1（a）（b）（c）（d）。其中細(xì)菌分離部位為肝臟和脾臟組織。

圖1 發(fā)病草魚

1.2 主要試劑

營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、瓊脂粉購于青島海博生物技術(shù)有限公司，細(xì)菌基因提取試劑盒、PCR 產(chǎn)物回收試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司，藥敏分析試劑板購于南京菲恩醫(yī)療科技有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離純化

對有出血癥狀瀕臨死亡的草魚體表用酒精消毒，在無菌條件下解剖后，用滅菌的接種環(huán)取肝臟和脾臟的少許組織樣，劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察菌落的形態(tài)和顏色，再挑取優(yōu)勢單菌落于普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

1.4 細(xì)菌基因組提取和16S rDNA PCR 擴(kuò)增

在無菌條件下，取500 μL 菌懸液，按照細(xì)菌DNA 提取試劑盒的說明方法進(jìn)行提取操作。以菌懸液提取的DNA 為模板，用擴(kuò)增16S rDNA 基因序列的通用引物 27F（5’-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3’）和 1429R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件是：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用1.2 %瓊脂糖凝膠（含有GoldView 核酸染色劑）進(jìn)行電泳檢測。電泳條件是：恒壓電壓120 V，時間20 min。電泳結(jié)束后用凝膠成像儀拍照。PCR 產(chǎn)物用試劑盒回收后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序分析。

1.5 序列比對與進(jìn)化樹構(gòu)建

測序結(jié)果通過NCBI 網(wǎng)站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線程序進(jìn)行Blastn 比對，并利用MEGA 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 藥敏試驗(yàn)

挑取純化后的單個菌落于5 mL 生理鹽水中，配制0.5 MCF 的菌懸液制成A 管；取2 支10 mL的無菌生理鹽水，打開任意一瓶，以無菌的方式向陰性對照孔分別加入200 μL 的無菌生理鹽水；從A 管中吸取200 μL 菌懸液加至打開的10 mL 無菌生理鹽水中制成B 管。將B 管所有菌液倒入經(jīng)滅菌的V 形槽中，再將另一支10 mL 無菌生理鹽水倒入V 形槽中?；靹蚝?，利用微量移液器吸取V形槽中的菌液加至所有微孔中（陰性對照除外）200 μL；將藥敏分析試劑板放入28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，經(jīng)肉眼觀察證實(shí)無細(xì)菌生長試管中的最低藥物濃度，孔內(nèi)液體渾濁為陽性（+），孔內(nèi)液體澄清為陰性（-），最低藥物濃度即藥物的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration, MIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理樣本的癥狀

春季末，塘口魚浮頭較多，游行緩慢，采集的病魚體表有明顯出血癥狀，尾鰭發(fā)白，解剖后發(fā)現(xiàn)魚鰾有樹枝狀出血癥狀。

2.2 菌落形態(tài)

分離出的w7 菌在瓊脂培養(yǎng)基中長勢良好，顏色呈乳白色，圓潤、微凸，邊緣整齊，見圖 2（a）（b）。

圖2 分離菌株w7 的菌落形態(tài)

2.3 分離菌株w7 的藥敏結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1 可見，從草魚肝臟和脾臟中分離得到的w7 對恩諾沙星、硫酸新霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、磺胺甲唑+甲氧芐啶敏感，對甲砜霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉中度敏感，對氟甲喹耐藥。

表1 8 種抗菌藥物對分離菌株的最小抑菌濃度（MIC）對照①

2.4 16S rDNA 序列分析

用16S rDNA 引物可從分離菌的基因組中擴(kuò)增出一條分子質(zhì)量約為1 400 bp 特異性的條帶（圖3）?；?6S rDNA 序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。由圖4 可見，分離菌株與鰻弧菌775 株的親緣關(guān)系最近。PCR 產(chǎn)物回收后直接進(jìn)行PCR 產(chǎn)物測序，序列長度1 239 bp，序列比對結(jié)果如圖5，根據(jù)比對結(jié)果將該分離菌株分類至鰻弧菌（Vibrio anguillarum），并將該菌株命名為w7 株。

圖3 分離菌株w7 的PCR 檢測結(jié)果

圖4 基于16S rDNA 序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 分離菌株w7 的BLAST 比對結(jié)果

3 討論

鰻弧菌是危害魚類的主要的條件致病菌之一，能使世界范圍內(nèi)的多種海水、淡水養(yǎng)殖魚類及其他養(yǎng)殖動物患弧菌病，通常在鱸、牙鲆、大菱鲆等海水養(yǎng)殖動物中發(fā)現(xiàn)較多[6-7]，而引起草魚發(fā)病的案例鮮有報(bào)道。有研究表明，鰻弧菌是水環(huán)境微生物區(qū)系中的正常菌群，當(dāng)水溫較高、營養(yǎng)較豐富時菌群數(shù)量急劇增加[8]，特別是在養(yǎng)殖密度、鹽度和有機(jī)物含量較高的環(huán)境下易誘發(fā)鰻弧菌病。推測春季氣溫變化較大，尤其是陡然出現(xiàn)高溫天氣，可能導(dǎo)致水體營養(yǎng)豐富、鹽度升高，從而造成疾病突發(fā)。根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道[5，9]，部分感染鰻弧菌的魚體表會出現(xiàn)局部褪色，鰭條、鰭基部及鰓骨下部充血發(fā)紅，肛門紅腫，繼而肌肉組織有彌散性或點(diǎn)狀出血，體表發(fā)黑，鰭部出現(xiàn)潰爛等癥狀，這與該研究中的發(fā)病草魚樣本的癥狀有諸多相似。因此在草魚的養(yǎng)殖生產(chǎn)中，注意細(xì)菌疾病的防范顯得尤為關(guān)鍵。值得注意的是，目前關(guān)于草魚感染弧菌導(dǎo)致生理病變甚至死亡的報(bào)道比較少見，僅在2019 年報(bào)道過天津的養(yǎng)殖場內(nèi)出現(xiàn)過創(chuàng)傷弧菌感染草魚的案例[5]。

在漁業(yè)養(yǎng)殖中，抗生素的頻繁使用會增強(qiáng)病原體的耐藥性，且抗生素的殘留會影響魚類尤其是一些食用魚的安全。該研究中，鰻弧菌對恩諾沙星、鹽酸多西環(huán)素、硫酸新霉素、氟苯尼考和磺胺甲唑+甲氧芐啶5 種抗菌藥敏感，抑菌效果較好；而對氟甲喹產(chǎn)生了耐藥性，幾乎沒有抑菌效果。因此，藥物敏感性試驗(yàn)可以高效地篩選出抑菌效果明顯的抗生素，對癥下藥，從而避免了抗生素的濫用和魚類死亡加劇，在一定程度上能顯著地減少養(yǎng)殖戶的損失。