劉光大，吳建雄，王書源，黃 雁，楊琳妹，何樞衡

合肥億帆生物制藥有限公司，合肥 230000

復(fù)方銀花解毒顆粒是由10 味中藥組成的復(fù)方制劑。該方來源于臨床經(jīng)驗方“銀花解毒湯”，方中山銀花、連翹為君藥。銀花味甘性寒，氣味芳香，連翹苦而微寒，輕清上浮，兩藥皆能解表透邪、清熱解毒。臣藥為荊芥、豆豉、薄荷，有疏散解表之功，共助君藥開皮毛而散熱。佐藥青蒿芳香透邪；大青葉清熱涼血；野菊花、鴨跖草清熱解毒；前胡宣散風(fēng)熱，肅肺化痰。諸藥合用，具有疏表透邪、輕宣肺氣的作用，適用于普通感冒、流行性感冒的風(fēng)熱癥候。

復(fù)方銀花解毒顆?，F(xiàn)行藥品標(biāo)準(zhǔn)收載于《新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》第75 冊，除薄層鑒別外，主要通過HPLC法對制劑中綠原酸含量進(jìn)行定量分析，為便于全面控制藥品質(zhì)量，宜建立更加有效的質(zhì)量評價方法。

中藥指紋圖譜結(jié)合多個有效組分含量測定是控制中藥質(zhì)量的有效方法[1]。聚類分析（CA）、主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法-判別分析（OPLSDA）等化學(xué)計量學(xué)分析方法，可以充分整合指紋圖譜提供的多維信息，有利于揭示中藥復(fù)方制劑復(fù)雜成分間隱藏的規(guī)律[2]。本研究采用HPLC 法建立了復(fù)方銀花解毒顆粒的指紋圖譜，標(biāo)定了來源于山銀花、連翹、青蒿、大青葉、野菊花等5 味藥材中的15個共有指紋峰；采用相似度評價結(jié)合上述化學(xué)計量學(xué)識別方法對指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；同時對鑒別出的8 個化學(xué)成分進(jìn)行含量測定，從定性與定量兩個方面對復(fù)方銀花解毒顆粒的質(zhì)量進(jìn)行評價。

1 材 料

1.1 儀器

Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；ME204E/MS105DU 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品及試劑

對照品：綠原酸（批號110753-201817，純度96.8%）、連翹酯苷A（批號111810-201707，純度97.2%）、連翹苷（批號110821-201816，純度95.1%）、蒙花苷（批號111528-201911，純度98.5%）均購于中國食品藥品檢定研究院；新綠原酸（批號4974，純度98.0%）、隱綠原酸（批號3208，純度98.3%）、異綠原酸B（批號3089，純度99.7%）、異綠原酸A（批號7692，純度98.7%）、4，5-二-O-咖啡酰奎寧酸（批號3001，純度99.2%）均購于上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)有限公司。

供試品：復(fù)方銀花解毒顆粒（批號：190301、1903008、1903009、190312、190313、190315、190401、190402、190407、190408、180903、180906、180910、180911、180917，分別編號為S1-S15）由天長億帆制藥有限公司生產(chǎn)；山銀花、連翹、荊芥、淡豆豉、薄荷、青蒿、大青葉、野菊花、前胡、鴨跖草均購自芍花堂國藥股份有限公司。

乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，5%～10%A；10～25 min，10%～13%A；25～50 min，13%～20% A；50～60 min，20%～32% A；60～65 min，32%～42%A）；指紋圖譜檢測波長230 nm，含量測定檢測波長330 nm；柱溫：30 ℃；體積流量：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于5000。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取對照品新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、4，5-二-O-咖啡?？鼘幩?、連翹苷、蒙花苷適量，置于100 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，即得（質(zhì)量濃度分別為20.6、50.7、21.6、48.3、20.2、41.0、32.2、21.0、20.1 μg·mL-1）。

2.2.2 供試品溶液 取本品適量，研細(xì)，稱取約0.3 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min（400 W，40 kHz），放至室溫，稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足失重，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 單味藥材顆粒樣品溶液 按本品現(xiàn)行的藥品標(biāo)準(zhǔn)中的制法，將處方中各味藥材分別制備成單味藥材顆粒，并按“2.2.2”項下方法制備單味藥材顆粒樣品溶液。

2.2.4 陰性顆粒樣品溶液 按本品現(xiàn)行的藥品標(biāo)準(zhǔn)中的制法，分別制備缺山銀花、連翹、野菊花、青蒿、大青葉5 味藥材的陰性顆粒，并按“2.2.2”項下方法制備陰性顆粒樣品溶液。

2.3 HPLC 指紋圖譜研究

2.3.1 進(jìn)樣精密度試驗 取供試品（S15），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件檢測，連續(xù)進(jìn)樣6 次。測得15 個共有峰保留時間的RSD 值均＜0.5%，峰面積的RSD 值均＜2.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗 取供試品（S15）適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件檢測。計算15 個共有峰保留時間和峰面積的RSD；計算各共有峰的峰面積RSD 時，以峰面積和取樣量的比值代替峰面積進(jìn)行計算。結(jié)果表明，各共有峰保留時間的RSD 值均＜0.5%，峰面積的RSD 值均＜3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品（S15），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在制備后的0、3、6、12、18、24 h，按“2.1”項下色譜條件檢測。測得15 個共有峰保留時間的RSD 值均＜0.5%，峰面積的RSD值均＜2.0%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 對照指紋圖譜的建立及相似度評價 取供試品15 批（S1～S15），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。采用2012版“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”分析指紋圖譜，選擇S1 做為參照圖譜，采用多點校正后進(jìn)行Mark 峰匹配，生成對照指紋圖譜，結(jié)果見圖1。

將15 批供試品色譜圖與對照指紋圖譜進(jìn)行相似度評價，S1～S15 相似度分別為0.991、0.990、0.990、0.990、0.995、0.990、0.976、0.976、0.976、0.976、0.976、0.977、0.981、0.982、0.962。15 批樣品與對照指紋圖譜的相似度均較高，表明不同批次樣品的質(zhì)量較為接近。

2.3.5 共有峰指認(rèn)與歸屬 按“2.2.1”、“2.2.2”、“2.2.3”、“2.2.4”項下方法制備對照品溶液、供試品溶液、單味藥材顆粒樣品溶液及陰性顆粒樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析。通過保留時間和DAD 紫外吸收圖譜對照分析，確定了各共有峰對應(yīng)的化學(xué)成分和藥材歸屬。混合對照品、供試品以及陰性顆粒樣品的HPLC 色譜圖見圖2；供試品以及各單味藥材顆粒樣品的HPLC 色譜圖見圖3。各共有峰對應(yīng)的化學(xué)成分和藥材歸屬見表1。

表1 復(fù)方銀花解毒顆粒共有峰歸屬

圖2 復(fù)方銀花解毒顆粒指紋圖譜峰指認(rèn)結(jié)果

圖3 復(fù)方銀花解毒顆粒共有峰歸屬

2.3.6 聚類分析（CA）采用SPSS 25.0 軟件，以15批復(fù)方銀花解毒顆粒樣品中15 個共有峰的相對峰面積為變量，采用組間聯(lián)接系統(tǒng)聚類法，以平方歐氏距離（squared euclidean distance）為測度，進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4。

當(dāng)平方歐式距離為15 時，15 批供試品可聚為2 類：第Ⅰ類包括供試品S1～S10；第Ⅱ類包括供試品S11～S15。分析結(jié)果表明，不同批次復(fù)方銀花解毒顆粒的指紋圖譜存在一定差異，這可能與制劑所用藥材的批間質(zhì)量差異有關(guān)。

2.3.7 主成分分析（PCA）采用SIMCA 14.1 軟件，以15 批復(fù)方銀花解毒顆粒樣品中15 個共有峰的峰面積為變量，進(jìn)行主成分分析。分析結(jié)果表明，前2 個主成分的累計貢獻(xiàn)率為93.6%，能夠概括樣品數(shù)據(jù)的絕大部分信息。因此，本研究以貢獻(xiàn)率最大的2 個主成分為坐標(biāo)軸，構(gòu)建主成分平面，在損失少量信息的前提下，通過降維的方式將樣品的多元變量投影在二維平面上，觀察樣品的整體分布情況及各變量對樣品分布的貢獻(xiàn)大小[3]，結(jié)果見圖5、圖6。由圖5 得分散點圖可知，15 批供試品數(shù)據(jù)均落在95%置信區(qū)間內(nèi)，說明各批次樣品化學(xué)成分基本一致，質(zhì)量較為穩(wěn)定；同時15 批供試品又可以分為2 類：第Ⅰ類包括樣品S1～S10，第Ⅱ類包括樣品S11～S15，與聚類分析結(jié)果較為一致。由圖6 載荷圖可知，15 個共有峰對樣品分布情況的貢獻(xiàn)不同，其中9 號峰、7 號峰、1 號峰、8 號峰、15 號峰、3 號峰、12 號峰、10 號峰距離中心點較遠(yuǎn)，表明對復(fù)方銀花解毒顆粒樣品分布的貢獻(xiàn)率相對較大。

圖5 15 批復(fù)方銀花解毒顆粒PCA 得分散點圖

2.3.8 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）在上述主成分分析的基礎(chǔ)上，對分為2 類的15 批樣品進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別分析，以篩選出對15 批樣品貢獻(xiàn)率較大的色譜峰，所得變量重要性投影值圖（VIP 圖）見圖7。

VIP 圖按照各成分對產(chǎn)品分類的影響大小進(jìn)行各共有峰排序，成分的VIP 越大，對產(chǎn)品分類的貢獻(xiàn)越大，當(dāng)VIP 值＞1 時，表明該成分對產(chǎn)品質(zhì)量的影響具有統(tǒng)計學(xué)意義，可以選做差異標(biāo)志物[4]。結(jié)合圖6 主成分分析載荷圖和圖7VIP 圖，共篩選出5個差異標(biāo)志物，根據(jù)VIP 值大小依次為：峰9（連翹酯苷A）、峰7、峰8、峰1、峰3（綠原酸）；結(jié)合共有峰歸屬結(jié)果可知，這5 個峰主要來自君藥山銀花和連翹兩味藥材。

圖6 15 批復(fù)方銀花解毒顆粒PCA 載荷圖

圖7 15 批復(fù)方銀花解毒顆粒囊OPLS-DA 分析VIP 圖

2.4 含量測定

在上述研究的基礎(chǔ)上，對包括連翹酯苷A、綠原酸2 個差異標(biāo)志物在內(nèi)的8 個化學(xué)成分的含量進(jìn)行定量分析。

2.4.1 溶液配制 對照品溶液、供試品溶液及陰性顆粒樣品溶液依次按“2.2.1”、“2.2.2”、“2.2.4”項下方法制備。

2.4.2 專屬性考察 按“2.2.1”、“2.2.2”、“2.2.4”項下方法制備對照品溶液、供試品溶液及陰性顆粒樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，結(jié)果見圖8。由此可知陰性樣品無干擾，本方法專屬性良好。

圖8 復(fù)方銀花解毒顆粒含量測定色譜圖

2.4.3 線性關(guān)系考察 按“2.2.1”項下方法制備含新綠原酸71.5 μg·mL-1、綠原酸272.0 μg·mL-1、隱綠原酸60.5 μg·mL-1、連翹酯苷A 165.7 μg·mL-1、異綠原酸B 137.1 μg·mL-1、異綠原酸A 183.1 μg·mL-1、4，5-二-O-咖啡?？鼘幩?89.0 μg·mL-1、蒙花苷88.2 μg·mL-1的混合對照品儲備液。取該儲備液，用50%甲醇溶液倍比稀釋，依次精密稀釋為原濃度的1/2 倍、1/4 倍、1/8 倍、1/16 倍、1/32 倍、1/64 倍的濃度，得到系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件依次進(jìn)樣檢測。以對照品濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸。8 個化學(xué)成分的回歸方程見表2。

表2 8 個化學(xué)成分回歸方程與線性范圍

結(jié)果表明，進(jìn)樣體積為10 μL 時，8 個化學(xué)成分的質(zhì)量濃度在一定的范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.4.4 進(jìn)樣精密度試驗 取供試品（S15）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件檢測，連續(xù)進(jìn)樣6 次。測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、4，5-二-O-咖啡?？鼘幩?、蒙花苷8 個成分的峰面積RSD 均＜0.5%，表明儀器精密度良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗 取供試品（S15）適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，取“2.2.1”項下制備得到的對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件檢測對照品和供試品溶液。測得8 個成分的含量RSD 均＜1.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品（S15）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在制備后的0、3、6、12、18、24 h，按“2.1”項下色譜條件檢測。測得8 個成分峰面積的RSD 值均＜0.5%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 準(zhǔn)確度試驗 取供試品（S15）約0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入“2.4.3”項下混合對照品儲備液2 mL，其余操作步驟按“2.2.2”項下方法進(jìn)行，制備供試品溶液，平行6 份；取“2.2.1”項下制備得到的混合對照品溶液；按“2.1”項下色譜條件檢測對照品和供試品溶液。根據(jù)檢測結(jié)果及對照品加入量，計算各成分的平均加樣回收率和RSD 值，計算得到新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、4，5-二-O-咖啡酰奎寧酸、蒙花苷的平均加樣回收率分別為100.3%、102.7%、99.2%、97.6%、101.6%、101.0%、102.2%、100.5%，RSD 值分別為1.2%、1.1%、1.5%、1.1%、0.7%、1.2%、0.8%、1.3%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.4.8 樣品測定 分別取15 批供試品（S1～S15）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液；取“2.2.1”項下制備得到的對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件檢測對照品和供試品溶液。計算樣品中8 個化學(xué)成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 15 批復(fù)方銀花解毒顆粒中8 種成分含量測定結(jié)果（n=3）

現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，每袋（15 g）顆粒含綠原酸不得低于30 mg，即每克顆粒含綠原酸不得低于2 mg；由實驗結(jié)果可知，15 批供試品均符合現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，但是不同批次顆粒中各成分含量存在一定差異，這可能是該制劑所用藥材的質(zhì)量存在差異所致。

3 討論

3.1 檢測方法的優(yōu)化

本研究采用DAD 檢測器在190～400 nm 范圍內(nèi)對供試品溶液進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在230 nm處色譜峰信息較為豐富，且基線較為平穩(wěn)，故選擇230 nm 作為指紋圖譜檢測波長；新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、4，5-二-O-咖啡酰奎寧酸、蒙花苷8 種化學(xué)成分的最大吸收波長均在330 nm 附近；并且在330 nm 波長下，各色譜峰分離度良好，8 個成分的色譜峰峰純度匹配值均＞0.985，表明各色譜峰純度較高，故選擇330 nm 作為含量測定的檢測波長。

本研究考察了不同提取方式（回流、超聲）、不同提取溶劑（甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、水）、不同提取時間（15、30、45 min）、不同流動相體系（乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液）、不同柱溫（25 ℃、30 ℃、35 ℃）等因素[5-8]的影響。結(jié)果表明，樣品采用50%甲醇25 mL 超聲提取30 min，可以兼顧提取效率、色譜峰峰型以及基線平穩(wěn)度；當(dāng)流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液、柱溫為30 ℃時，各色譜峰峰形和分離度較好。

3.2 指紋圖譜及模式識別分析

指紋圖譜結(jié)果顯示，15 批供試品與對照指紋圖譜的相似度均≥0.962，表明不同批次樣品間相似度較高，整體質(zhì)量較為穩(wěn)定。聚類分析和主成分分析均將15 批樣品分成2 類，這可能與不同批次制劑所用藥材產(chǎn)地、采收期各異等因素有關(guān)。OPLS-DA分析結(jié)果顯示，模型解釋率參數(shù)R2Y=0.999，預(yù)測能力參數(shù)Q2=0.995，均高于0.5，且兩者之差較小，說明模型擬合程度較好，具有較強(qiáng)的預(yù)測性和穩(wěn)定性。設(shè)置分類Y 矩陣變量、隨機(jī)排列200 次做置換檢驗，R2擬合直線在Y 坐標(biāo)軸的截距為0.184，低于模型解釋率R2Y（0.999），且＜0.3，說明所建模型可靠；得Q2擬合直線截距為0.757，低于模型預(yù)測度Q2，且＜0.05，說明所建模型可靠，不存在過度擬合現(xiàn)象[9]。PCA 和OPLS-DA 分析結(jié)果顯示，主要來源于君藥山銀花、連翹兩味藥材的峰9（連翹酯苷A）、峰7、峰8、峰1、峰3（綠原酸）對不同批次制劑的分類影響較大。為了提高產(chǎn)品的均一性和穩(wěn)定性，后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對山銀花、連翹這兩味藥材的質(zhì)量控制來減少批間質(zhì)量差異；同時在生產(chǎn)過程中對這些差異標(biāo)志物建立質(zhì)量控制體系。

3.3 定量指標(biāo)的選擇

本研究通過對照品對照指認(rèn)出新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、連翹酯苷A、異綠原酸B、異綠原酸A、4，5-二-O-咖啡?？鼘幩帷⒚苫ㄜ? 個成分。山銀花、連翹均具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效[10]，其中綠原酸類多酚成分是山銀花中抗菌、抗病毒的主要有效成分[11]；連翹酯苷A 作為連翹的主要指標(biāo)成分之一，具有顯著的抗炎、抗菌、抗病毒作用[12，13]。結(jié)合PCA和OPLS-DA 分析結(jié)果，選擇與制劑功效相關(guān)，且包含了連翹酯苷A 和綠原酸2 個差異標(biāo)志物的8 個化學(xué)成分進(jìn)行定量分析。

4 小 結(jié)

本研究采用HPLC 法建立了復(fù)方銀花解毒顆粒的指紋圖譜并同時測定多成分含量的分析方法，能夠全面反映出制劑的化學(xué)成分和定量信息，同時結(jié)合多元統(tǒng)計分析能系統(tǒng)地對復(fù)方銀花解毒顆粒進(jìn)行全面的質(zhì)量評價。該方法簡便、準(zhǔn)確，可用于該制劑的整體質(zhì)量控制，為全面評價該制劑質(zhì)量提供參考依據(jù)。