岳秀娟 李慶 王珊珊 陳德喜 石英

近年來，隨著核苷(酸)類似物(NA)在臨床的廣泛應(yīng)用，一些乙型肝炎患者在得到很好的治療同時(shí)面臨著耐藥的風(fēng)險(xiǎn)。臨床上常用的NA有拉米夫定、替比夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋和替諾福韋等。恩替卡韋和替諾福韋因?yàn)槟退幤琳细摺⒖共《拘Ч麖?qiáng)被《慢性乙型肝炎防治指南》[1]推薦為一線用藥。本研究主要分析恩替卡韋基因型耐藥情況，為臨床了解恩替卡韋耐藥特點(diǎn)、流行信息及臨床合理用藥提供參考。

資料與方法

一、標(biāo)本收集

2009年1月至2020年10月北京佑安醫(yī)院就診的恩替卡韋基因型耐藥株感染者786例作為研究對(duì)象。恩替卡韋基因型耐藥株感染者是指HBV POL區(qū) 耐藥位點(diǎn)rtL180M+rtM204V雙陽(yáng)性(或者僅rtM204I陽(yáng)性)并且 rtV173、rtT184、rtS202、rtV169和rtV250等5個(gè)位點(diǎn)中任一個(gè)或一個(gè)以上陽(yáng)性者。為了敘述方便，將rtL180M+rtM204V雙陽(yáng)性和rtM204I陽(yáng)性者簡(jiǎn)稱為拉米夫定基因型耐藥并用LAMr表示，下文中所述rtV173、rtT184、rtS202、rtI 169、rtM 250單位點(diǎn)或多位點(diǎn)突變，均是指在LAMr基礎(chǔ)上同時(shí)合并上述5種位點(diǎn)之一或一個(gè)以上陽(yáng)性。上述任一耐藥突變類型如果合并A181和(或)N236兩個(gè)位點(diǎn)突變陽(yáng)性者則被排除。

二、 儀器與試劑

ABI 3500XL DX 遺傳分析儀(賽默飛世爾科技有限公司)；核酸提取試劑盒(A36420，中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)，乙型肝炎病毒基因突變檢測(cè)試劑盒(PCR-測(cè)序法)(A15077，廣州立菲達(dá)安診斷產(chǎn)品技術(shù)有限公司)。

三、 HBV DNA 的提取

收集患者空腹靜脈血5 mL，離心后取血清。1.5 mL離心管中先后加入蛋白酶K、血清及裂解液，振蕩混勻，高速離心10 s， 72℃ 10 min，加入250 μL乙醇，渦旋振蕩15 s；將混合液吸至離心柱，高速離心1 min，再分別將500 μL的抑制物去除液和去離子液(2次)加入離心柱，高速離心，14 000×g離心3 min去除殘余乙醇；將離心柱放到新的1.5 mL離心管，72℃放置2 min，在離心柱的膜上方加入預(yù)熱的洗脫液，室溫靜置后高速離心1 min，所得即為核酸溶液。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(%)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、恩替卡韋基因耐藥株感染者基本情況

恩替卡韋基因耐藥患者786例，男617例，女169例，年齡為(45.7±11.5)歲。其中HBV基因型B亞型79例(10.05%)、C亞型705例(89.69%)、D亞型2例(0.25%)。

二、恩替卡韋基因耐藥突變類型

786例恩替卡韋基因耐藥株感染者的HBV基因耐藥突變類型共計(jì)21種，耐藥突變類型見表1。

表1 21種恩替卡韋基因耐藥突變類型

三、各突變位點(diǎn)單點(diǎn)突變和多點(diǎn)突變情況

按突變位點(diǎn)計(jì)算，rtT184位點(diǎn)突變率最高，其次是rtV173位點(diǎn)突變，rtI169位點(diǎn)突變率最低，rtV173位點(diǎn)、rtS202位點(diǎn)及rtT184位點(diǎn)以單位點(diǎn)突變?yōu)橹饕蛔冃问剑瑀tM250位點(diǎn)單位點(diǎn)突變與聯(lián)合突變例數(shù)相差無幾，而rtI169位點(diǎn)以與其他4個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合突變?yōu)橹饕蛔冃问?。見?。

表2 五個(gè)突變位點(diǎn)單點(diǎn)和多點(diǎn)突變情況[例(%)]

四、 不同耐藥位點(diǎn)在不同性別樣本中的變異情況

為了探究耐藥位點(diǎn)的突變與性別之間是否有關(guān)系，采用Fisher確切概率法對(duì)不同位點(diǎn)突變進(jìn)行了性別間的比較，結(jié)果顯示，女性患者在rtV173位點(diǎn)更容易發(fā)生突變，而男性患者則在rtS202位點(diǎn)更容易發(fā)生突變，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

五、 不同耐藥位點(diǎn)在不同年齡組中的變異情況

各位點(diǎn)在不同年齡組的占比各有特點(diǎn)，rtT184位點(diǎn)在≥60歲年齡組占比最高，rtV173在≤30歲年齡組占比最高，rtS202則在30～60歲年齡組占比最高。將各位點(diǎn)在不同年齡組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，rtT184位點(diǎn)和rtV173位點(diǎn)在不同年齡組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他3位點(diǎn)在不同年齡組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

六、 不同耐藥位點(diǎn)在不同HBV基因型中的變異情況

結(jié)果顯示rtV173、rtS202、rtM250在HBV不同基因亞型中的變異差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，rtV173更容易在C亞型中發(fā)生突變，rtS202和rtM250更容易在B亞型中發(fā)生突變，見表3。

表3 各位點(diǎn)在B、C亞型間的變異情況[例(%)]

討 論

NA類藥物雖然可以有效抑制病毒復(fù)制和改善肝功能，但不能使病毒徹底清除，也很難實(shí)現(xiàn)HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，這就需要長(zhǎng)期甚至終身服用，而長(zhǎng)期服藥就帶來了耐藥風(fēng)險(xiǎn)[2-4]。研究表明，HBV耐藥首先由基因型耐藥引起，進(jìn)而造成病毒學(xué)突破和生化突破，最終導(dǎo)致臨床治療失敗。因此,重視基因型耐藥突變的監(jiān)測(cè)和分析,可以幫助臨床及早發(fā)現(xiàn)耐藥，及時(shí)調(diào)整治療方案[5-6]。

恩替卡韋5年的累積耐藥發(fā)生率為1.2%；在對(duì)拉米夫定耐藥的CHB患者中，恩替卡韋治療5年的累積耐藥發(fā)生率升至51%。由于恩替卡韋在我國(guó)上市之前，已經(jīng)累積了相當(dāng)數(shù)量的拉米夫定經(jīng)治患者，因此了解真實(shí)世界中恩替卡韋耐藥情況及特征，對(duì)于臨床治療決策具有重要參考價(jià)值[7-9]。

本研究結(jié)果顯示，786例恩替卡韋基因型耐藥患者中rtT184位點(diǎn)突變最常見，而rtI169位點(diǎn)突變少見并且以與其他位點(diǎn)同時(shí)突變?yōu)橹?，與劉妍等[4]的研究結(jié)果一致。HBV耐藥突變與基因型相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)rtV173、rtS202、rtM250等3個(gè)位點(diǎn)突變與HBV基因型相關(guān)，rtV173更容易在C亞型中發(fā)生突變，rtS202和rtM250更容易在B亞型中發(fā)生突變；而rtT184、rtI169兩個(gè)位點(diǎn)突變?cè)贖BV不同基因型之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，本研究結(jié)果顯示女性患者在rtV173位點(diǎn)更容易發(fā)生突變，而男性患者則在rtS202位點(diǎn)更容易發(fā)生突變，而其他位點(diǎn)在男女之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在不同年齡組的比較中發(fā)現(xiàn)rtT184位點(diǎn)在≥60歲年齡患者中更容易突變，而rtV173位點(diǎn)突變則在≤30歲年齡患者中更容易發(fā)生，這與以往報(bào)道不同[10-14]。

本研究對(duì)真實(shí)世界中HBV恩替卡韋耐藥類型、不同耐藥位點(diǎn)在人群中的分布特點(diǎn)及不同耐藥位點(diǎn)在HBV不同基因型中的突變情況做了分析和闡述，對(duì)于臨床深入了解HBV恩替卡韋耐藥特點(diǎn)及合理調(diào)整用藥具有意義。