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        花椒與辣椒協(xié)同抗氧化作用評(píng)價(jià)研究

        2022-01-12 02:34:38彭青盧云浩何強(qiáng)
        中國(guó)調(diào)味品 2022年1期
        關(guān)鍵詞:亞硝酸鹽花椒清除率

        彭青,盧云浩,何強(qiáng)

        (四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院,成都 610065)

        亞硝酸鹽作為防腐劑和發(fā)色劑被廣泛應(yīng)用于肉制品加工,當(dāng)以活性亞硝酸和一氧化氮形式存在時(shí),與次級(jí)胺類物質(zhì)生成具有強(qiáng)致癌性的亞硝胺類化合物[1];自由基在人體代謝中失衡時(shí),同樣會(huì)導(dǎo)致人體正常細(xì)胞和組織損壞,引起多種疾病,而對(duì)人體健康產(chǎn)生危害[2]。研究表明,維生素、酚類、類黃酮等天然抗氧化劑可清除自由基或抑制電子傳遞,并能有效阻斷亞硝酸根與仲胺的結(jié)合生成N-亞硝胺[3-4],從而有益人體健康。此外, 不同抗氧化劑之間存在一定的協(xié)同效應(yīng), 按不同比例將單一的抗氧化劑混合使用可以達(dá)到更理想的抗氧化效果[5]。

        花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)和辣椒(CapsicumannuumL.)廣泛分布于中國(guó)西南等地,作為傳統(tǒng)的藥食兩用香辛料,被大量混合使用于餐桌調(diào)味。研究發(fā)現(xiàn)花椒、辣椒中富含生物堿、多酚、辣椒素、類胡蘿卜素等多種生物活性成分,具有抗癌、抗氧化、抗菌等多種藥理作用[6-9]。目前,對(duì)于兩者聯(lián)合使用的抗氧化能力尚不明確。因此,本研究基于花椒和辣椒飲食的烹飪工藝,采用不同的浸提工藝提取兩者的活性物質(zhì),基于NO2-·、DPPH·、ABTS+·自由基體外清除模型,探討了花椒和辣椒協(xié)同抗氧化的作用效果,以期為合理搭配花椒與辣椒用于食品抗氧化以及人體健康提供科學(xué)指導(dǎo)。

        1 材料與方法

        1.1 試劑與儀器

        漢源紅花椒、紅辣椒:購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?;磺胺、鹽酸萘乙二胺、DPPH、ABTS:購(gòu)自Sigma公司(中國(guó)上海);亞硝酸鈉、過硫酸鉀:購(gòu)自成都科龍化工試劑廠;UV2000紫外可見分光光度計(jì):尤尼柯儀器有限公司;SOQ電子天平:賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;KQ3200DE超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 花椒-辣椒水提取物(ZCW)制備

        原料經(jīng)粉碎過40目篩后,分別稱取30 g花椒粉、辣椒粉、混合粉末(2∶1,W/W)于1000 mL沸水中蒸煮2 h,離心,然后將上清液旋蒸并用蒸餾水定容到100 mL容量瓶中,分別得到花椒水提物(ZW)、辣椒水提物(CW)和花椒-辣椒混合水提物(ZCW)。

        1.2.2 花椒-辣椒醇提取物(ZCE)制備

        原料經(jīng)粉碎過40目篩后,分別稱取30 g花椒粉、辣椒粉、混合粉末(2∶1,W/W)于1000 mL無(wú)水乙醇中加熱回流提取2 h,離心,然后將上清液旋蒸并用乙醇定容到100 mL容量瓶中,得到花椒醇提物(ZE)、辣椒醇提物(CE)和花椒-辣椒混合醇提物(ZCE)。

        1.3 亞硝酸鹽清除能力測(cè)定

        亞硝酸鹽清除能力的測(cè)定采用Griess reagent法[10]。取1 mL稀釋至一系列濃度梯度的提取樣液(0.2~1 mg/mL)與1 mL 1 mmol/L NaNO2和8 mLpH 3.0的檸檬酸鈉緩沖液混合,于37 ℃水浴中反應(yīng)2 h,得試樣反應(yīng)液,不加提取物作為對(duì)照組。取1 mL試樣反應(yīng)液加入1.5 mL Griess I試劑(磺胺5 g/L)于室溫反應(yīng)5 min后,加入1.5 mL Griess II試劑(鹽酸萘乙二胺1 g/L)于室溫繼續(xù)反應(yīng)5 min,于538 nm處測(cè)定吸光度。

        亞硝酸鹽清除率(%)=(A0-A1)/A0×100%。

        式中:A0為對(duì)照組吸光度,A1為實(shí)驗(yàn)組吸光度。

        1.4 DPPH自由基清除能力測(cè)定

        配制DPPH自由基工作液[11],取2 mL稀釋至一系列濃度梯度的提取物(0.02~0.1 mg/mL)與2 mL DPPH溶液混合,在25 ℃避光孵育30 min,于517 nm處測(cè)定反應(yīng)液的吸光度,以95%乙醇代替提取物做空白對(duì)照。DPPH自由基清除率的計(jì)算同1.3。

        1.5 ABTS自由基清除能力測(cè)定

        配制ABTS自由基工作液,取0.1 mL稀釋至一系列濃度梯度的提取物(0.2~1 mg/mL)同3.9 mL ABTS自由基工作液混合,在25 ℃條件下孵育6 min,于734 nm處測(cè)定反應(yīng)液的吸光度,以純水代替提取液做空白對(duì)照。ABTS自由基清除率同1.3。

        1.6 花椒和辣椒提取物協(xié)同抗氧化效果評(píng)價(jià)

        本文采用Chou-Talalay法對(duì)花椒和辣椒提取物協(xié)同抗氧化效果進(jìn)行評(píng)價(jià)[12]。

        1.6.1 中值效應(yīng)方程

        中效方程:Fa/Fu=(D/Dm)m。

        式中:D為藥物濃度;Fa為D濃度下物質(zhì)的清除率;Fu=1-Fa;Dm為中效濃度(IC50),是清除率50%時(shí)的濃度;m為量效關(guān)系曲線的系數(shù)。

        1.6.2 聯(lián)合指數(shù)(CI)

        將中值效應(yīng)方程應(yīng)用到兩種物質(zhì)的聯(lián)合使用,Chou和Talalay提出聯(lián)合指數(shù)CI來(lái)量化兩種物質(zhì)的協(xié)同或拮抗作用:

        式中:D1、D2為聯(lián)合使用時(shí)產(chǎn)生清除率X效應(yīng)兩物質(zhì)各自所需劑量。Dx1、Dx2為兩物質(zhì)單用時(shí)產(chǎn)生清除率X效應(yīng)各自劑量。CI=1,CI<1和CI>1分別表示兩物質(zhì)具有相加作用、協(xié)同作用、拮抗作用。

        1.6.3 劑量減少指數(shù)(DRI)

        物質(zhì)聯(lián)合使用前后的劑量變化幅度是評(píng)價(jià)聯(lián)合使用效果的重要指標(biāo),用來(lái)衡量相同作用水平下,協(xié)同使用時(shí)相比單獨(dú)使用時(shí)每種物質(zhì)劑量降低的倍數(shù)。

        1.7 數(shù)據(jù)處理

        采用SPSS 24.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,其中方差分析采用單因素-鄧肯分析,Origin 2018繪圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 提取物對(duì)NO2-·、DPPH·和ABTS+·的清除效果比較

        各提取物對(duì)NO2-·、DPPH·和 ABTS+·的清除能力及IC50值見圖1和表1。

        表1 各提取物清除NO2-·、 DPPH·和ABTS+·自由基的IC50值Table 1 IC50 values of extracts scavenging NO2-·,DPPH·and ABTS+ ·free radicals

        圖1 提取物對(duì)NO2-·(a)、DPPH·(b)和ABTS+·(c)清除濃度-效應(yīng)圖Fig.1 The scavenging concentration-effect diagram of extracts on NO2-·(a), DPPH·(b) and ABTS+·(c)

        由圖1可知,各提取物對(duì)NO2-·、DPPH·和ABTS+·的清除能力呈一定的量效關(guān)系,清除效果均隨濃度增大而增大,表明各提取物均具有良好的抗氧化活性,且醇提物的抗氧化活性優(yōu)于水提物。在亞硝酸鹽體系中,單獨(dú)使用花椒水提物ZW(400 μg/mL)和辣椒水提物CW(200 μg/mL)的清除率分別為46.23%和10.39%,而聯(lián)合花椒-辣椒水提取物ZCW(600 μg/mL)的清除率為65.88%,大于兩者單獨(dú)作用之和,且優(yōu)于600 μg/mL ZW的單獨(dú)作用(50.76%),說(shuō)明混合使用花椒和辣椒(2∶1,W/W)對(duì)亞硝酸鹽的清除效果更顯著,呈現(xiàn)協(xié)同作用。DPPH·和ABTS+·體系中呈現(xiàn)出了類似的結(jié)果。

        由表1可知,各提取物的抗氧化能力存在顯著性差異(p<0.05),在NO2-·和DPPH·清除體系中,各提取物抗氧化活性強(qiáng)弱為ZCE>ZCW>ZE>ZW>CE>CW;ABTS自由基體系中為ZCE>ZE>ZCW>ZW>CE>CW。

        2.2 聯(lián)合提取物ZCW和ZCE對(duì)NO2-·、DPPH·和ABTS+·清除效果相互作用分析

        聯(lián)合指數(shù)CI是用于評(píng)價(jià)物質(zhì)間的相互作用最簡(jiǎn)便可行的定量方法,CI<1物質(zhì)間呈協(xié)同作用,反之,呈拮抗作用。在NO2-·、DPPH·和ABTS+·清除體系中,ZW和CW、ZE和CE在低濃度時(shí)(清除率小于10%時(shí))呈現(xiàn)拮抗作用;而當(dāng)清除率大于10%時(shí),聯(lián)合水提物和醇提物均具有協(xié)同清除NO2-·、DPPH·和ABTS+·的作用(見圖2中 a~c)。

        圖2 ZCW、ZCE對(duì)NO2-·(a)、DPPH·(b)和ABTS+·(c)清除相互作用聯(lián)合指數(shù)圖Fig.2 The combined index diagram of interactions of ZCW and ZCE scavenging NO2-·(a), DPPH·(b) and ABTS+·(c)

        低濃度時(shí),體系中抗氧化劑的氫原子與極性溶劑或其中一些抗氧化劑形成氫鍵,使得周圍的氫原子產(chǎn)生兩個(gè)膨脹的雜原子,導(dǎo)致空間大量堵塞,其他游離的抗氧化劑無(wú)法接觸和清除自由基,從而產(chǎn)生拮抗作用[13]。此外,由圖2可知,隨著清除效果的增加,CI值呈逐漸降低的趨勢(shì),表明隨著濃度增加,混合提取物的協(xié)同作用越強(qiáng)。且在NO2-·、DPPH·體系中,ZCE的協(xié)同抗氧化效果較ZCW強(qiáng),而ABTS+·體系中則相反。推測(cè)是界面效應(yīng)引起的,ABTS+·是水溶性自由基,花椒-辣椒聯(lián)合水提物和ABTS聚集形成雙水界面,醇提物則可能由于溶劑效應(yīng),影響分子間排列的有序性,沒有與ABTS形成良好的雙水界面,而與脂溶性自由基DPPH形成油油界面,與NO2-·形成油水界面,達(dá)到協(xié)同抗氧化效果。

        根據(jù)表1結(jié)果以及劑量效應(yīng)關(guān)系繪制等效應(yīng)圖,橫軸分別標(biāo)記花椒提取物清除效應(yīng)為50%、75%、90%的濃度值(ED50、ED75、ED90),縱軸分別標(biāo)記辣椒提取物達(dá)到相應(yīng)清除效應(yīng)的濃度值(ED50、ED75、ED90),連接兩兩濃度值構(gòu)成相加線,當(dāng)花椒-辣椒聯(lián)合提取物達(dá)到相應(yīng)清除效應(yīng)的劑量濃度在相加線下方,表明聯(lián)合提取物具有協(xié)同作用;處于相加線上表示加和作用;處于相加線上方表示拮抗作用。

        由圖3可知,NO2-·、DPPH·和ABTS+·清除體系中,當(dāng)花椒-辣椒聯(lián)合提取物清除效應(yīng)為50%、75%和90%時(shí),聯(lián)合提取物ZCW(見圖3中a~c)和ZCE(見圖3中A~C)數(shù)據(jù)點(diǎn)均落在了斜邊之下,進(jìn)一步說(shuō)明聯(lián)合使用呈現(xiàn)協(xié)同抗氧化效果。原因可能是花椒-辣椒聯(lián)合提取物中的維生素C再生了槲皮素或蘆丁,從而使體系形成一個(gè)循環(huán)的氧化還原系統(tǒng);辣椒素能夠再生維生素E、酚酸氧化偶聯(lián)類胡蘿卜素,使得整個(gè)體系的抗氧化能力增強(qiáng),達(dá)到協(xié)同抗氧化效果[14-15]。且可以從圖3中看到在達(dá)到相同清除效果條件下花椒-辣椒聯(lián)合提取物的使用劑量低于花椒和辣椒單獨(dú)提取物的使用劑量。

        圖3 ZCW和ZCE對(duì)NO2-·(a和A)、DPPH·(b和B)和ABTS+·(c和C)清除等效應(yīng)圖

        2.3 提取物對(duì)NO2-·、DPPH·和ABTS+·清除效果劑量減少指數(shù)

        DRI值越大,說(shuō)明聯(lián)合使用時(shí)該物質(zhì)的使用劑量降低程度越明顯,同時(shí)也降低該物質(zhì)對(duì)機(jī)體的毒性。由圖4中a可知,亞硝酸鹽體系中,CW的log DRI高于ZW的log DRI,說(shuō)明聯(lián)合使用ZCW中CW的單一用量減少程度較ZW明顯;而隨著作用效果的增加,其log DRI在減少,說(shuō)明其單一用量減少程度不呈增大的趨勢(shì);由圖4中A可知,ZE和CE的log DRI均隨作用效果的增加而增大,說(shuō)明聯(lián)合使用ZCE中,ZE和CE的單一用量減少程度呈增大的趨勢(shì),且CE的減少程度較ZE明顯。

        圖4 ZCW和ZCE對(duì)NO2-·(a和A)、DPPH·(b和B)和ABTS+·(c和C)清除效應(yīng)與劑量減少指數(shù)對(duì)數(shù)圖Fig.4 Fa-log DRI plots of ZCW and ZCE scavenging NO2-·(a and A),DPPH·(b and B) and ABTS+·(c and C)

        DPPH自由基清除體系中,CW、ZW的log DRI均大于0,且CW的log DRI隨著作用效果增大不斷增大,說(shuō)明ZCW聯(lián)合使用提取物中對(duì)CW的用量減少倍數(shù)比較明顯(見圖4中b)。ZE和CE的log DRI均穩(wěn)定在0.5和0.25附近,但CE的log DRI大于ZE,說(shuō)明聯(lián)合使用的ZCE提取物對(duì)CE的使用量減少程度較ZE大(見圖4中B)。

        ABTS自由基清除體系中,CW的log DRI大于ZW的log DRI,并隨著清除效應(yīng)增大而緩慢上升,說(shuō)明聯(lián)合使用中CW的用量減少程度較ZW明顯(見圖4中c)。ZE和CE的log DRI均隨清除能力的增加而增加,說(shuō)明在ABTS體系中,CE和ZE的使用量在聯(lián)合使用中均一定程度地減少(見圖4中C)。以上分析進(jìn)一步說(shuō)明花椒和辣椒提取物具有協(xié)同抗氧化效果。

        3 結(jié)果

        本研究發(fā)現(xiàn)花椒和辣椒的醇提取物和水提取物對(duì)亞硝酸鹽、DPPH和ABTS自由基清除活性存在較大差異,花椒和辣椒醇提取物的清除活性分別優(yōu)于水提取物,當(dāng)對(duì)兩者進(jìn)行配比聯(lián)合提取后,表現(xiàn)出了一定程度的協(xié)同抗氧化作用,且在不同的抗氧化體系中,花椒-辣椒聯(lián)合水提物和醇提取物的協(xié)同抗氧化效果不一。研究為食品加工領(lǐng)域?qū)τ趤喯跛猁}的清除和典型香辛料的聯(lián)合使用提供一定指導(dǎo),奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

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