譚一羅，陳 鳳，張廣旭，王康君，郭明明，李曉峰，張夢涵，樊繼偉

（連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 連云港 222000）

小麥（Triticum aestivum L.）是世界主要糧食作物之一。隨著人民生活水平的提高，消費(fèi)者對有色食品的營養(yǎng)價(jià)值愈發(fā)關(guān)注，彩色小麥成為一個(gè)新的研究方向[1]。彩色小麥由于籽粒種皮或糊粉層的天然色素，呈現(xiàn)灰、紫、藍(lán)和綠等特殊粒色，含有較高的微量元素以及花青素，營養(yǎng)價(jià)值豐富，具有良好的保健作用和開發(fā)前景[2]。

近年來，小麥轉(zhuǎn)基因育種、基因編輯育種、基因功能等研究依賴小麥的高頻遺傳轉(zhuǎn)化體系提高了育種效率[3-5]。研究表明，基因型、培養(yǎng)基、外植體等均會(huì)對小麥的再生效率產(chǎn)生影響[6-9]。幼胚是小麥良好的外植體材料，再生能力強(qiáng)，但是取材常受時(shí)間和季節(jié)限制；成熟胚取材方便，不受時(shí)間、環(huán)境影響，且生理狀態(tài)相近，但較低的再生能力限制其在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。

目前，關(guān)于普通小麥的組織培養(yǎng)研究較多，已經(jīng)篩選出了較為合適的培養(yǎng)基和材料[10-12]。但是，關(guān)于彩色小麥組織培養(yǎng)的研究報(bào)道較少。對彩色小麥組織培養(yǎng)體系預(yù)試驗(yàn)表明，傳統(tǒng)的分化培養(yǎng)基[13]對彩色小麥愈傷組織成苗效果較差，且過長的愈傷誘導(dǎo)時(shí)間一方面導(dǎo)致愈傷組織在暗培養(yǎng)階段提前出芽，另一方面繼代培養(yǎng)增加了培養(yǎng)基污染風(fēng)險(xiǎn)。因此，本研究擬通過優(yōu)化彩色小麥愈傷誘導(dǎo)時(shí)間和分化培養(yǎng)基生長調(diào)節(jié)劑配比，篩選適合彩色小麥組織培養(yǎng)的基因型和培養(yǎng)基，以期為彩色小麥高效再生體系的建立提供理論依據(jù)，為高頻遺傳轉(zhuǎn)化提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

供試材料為3 個(gè)彩色小麥品種（系），分別為中黑麥6 號(hào)（深紫粒）、CM-Z2（紫粒）和中藍(lán)麥1 號(hào)（藍(lán)粒）。

1.2 培養(yǎng)基

采用MS 作為基本培養(yǎng)基，通過添加部分營養(yǎng)元素、瓊脂和生長調(diào)節(jié)劑得到誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基。分化培養(yǎng)基根據(jù)生長調(diào)節(jié)劑種類、濃度和配比的不同分為6 種；生根培養(yǎng)基采用1/2 MS 培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖、瓊脂和多效唑（MET）。不同培養(yǎng)基按表1 配制，在滅菌前調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 值至5.8，于121 ℃高壓滅菌20 min，不可高溫高壓滅菌的生長調(diào)節(jié)劑采用過濾除菌，于培養(yǎng)基高壓滅菌降至50 ℃以下單獨(dú)加入。

表1 培養(yǎng)基編號(hào)及成分配比

1.3 方法

1.3.1 消毒 每組材料分別選擇500 粒當(dāng)年收獲且籽粒飽滿的彩色小麥種子，先用流水將種子沖洗5～10 min，并用無菌水沖洗3 遍，再用75%乙醇將種子浸泡消毒5 min，然后于0.1%氯化汞溶液浸泡消毒15～20 min，期間振蕩4～5 次，最后用無菌水沖洗5 次，4 ℃條件下于無菌水中浸泡16～18 h。

1.3.2 外植體接種和誘導(dǎo)培養(yǎng) 將浸泡后的彩色小麥種子用0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min，期間每2 min 振蕩1 次，然后用無菌水沖洗4 次備用。取小麥籽粒放入經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min 的墊有無菌濾紙的培養(yǎng)皿，用解剖刀和鑷子無菌操作將籽粒的成熟胚取出。分別將成熟胚接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板，每皿約接種65 枚成熟胚，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，14 d 進(jìn)行繼代培養(yǎng)，分別于8、14、20 d 統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)情況。

1.3.3 分化培養(yǎng) 將未提前萌發(fā)的愈傷組織轉(zhuǎn)接至不同的分化培養(yǎng)基，25 ℃2 000 lx 光照培養(yǎng)，每天光照16 h，14 d 繼代1 次。統(tǒng)計(jì)分化過程中綠點(diǎn)、綠芽和愈傷褐變數(shù)量。

1.3.4 生根培養(yǎng) 待彩色小麥再生苗生長至3～5 cm，將幼苗轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基，于25 ℃2 000 lx 光照培養(yǎng)，每天光照16 h，統(tǒng)計(jì)成苗率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算出愈率、胚芽率、分化率、綠芽誘導(dǎo)率、成苗率、褐變率。

采用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型和誘導(dǎo)天數(shù)對彩色小麥出愈率的影響

由圖1 可知，中黑麥6 號(hào)和CM-Z2 誘導(dǎo)8 d 和14 d 的出愈率有顯著差異（P＜0.05），中藍(lán)麥1 號(hào)誘導(dǎo)8 d 和20 d 的出愈率有顯著差異（P＜0.05），說明在誘導(dǎo)初期出愈率隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加而上升；但3 個(gè)彩色小麥基因型在誘導(dǎo)14 d 和20 d 時(shí)出愈率均無顯著差異（P＞0.05），說明出愈率隨著誘導(dǎo)時(shí)間先上升后趨于穩(wěn)定。當(dāng)誘導(dǎo)20 d 時(shí)，中黑麥6 號(hào)、CM-Z2、中藍(lán)麥1 號(hào)的平均出愈率分別達(dá)到96.31%、85.07%和89.61%，中黑麥6 號(hào)與其他2 個(gè)品種出愈率存在顯著差異（P＜0.05），CM-Z2 和中藍(lán)麥1 號(hào)出愈率無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 基因型和誘導(dǎo)天數(shù)對出愈率的影響

2.2 基因型和誘導(dǎo)天數(shù)對彩色小麥胚芽率的影響

不同基因型和誘導(dǎo)天數(shù)對彩色小麥愈傷誘導(dǎo)階段的胚芽率存在影響。由圖2 可知，中黑麥6 號(hào)和中藍(lán)麥1 號(hào)在愈傷誘導(dǎo)階段的胚芽率隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加顯著增加（P＜0.05）；CM-Z2 的胚芽率雖然呈上升趨勢，但無顯著差異（P＞0.05）。中黑麥6 號(hào)胚芽率顯著高于CM-Z2 和中藍(lán)麥1 號(hào)（P＜0.05），誘導(dǎo)培養(yǎng)20 d 時(shí)胚芽率達(dá)到31.38%。彩色小麥成熟胚誘導(dǎo)14 d 后（圖3），彩色小麥的愈傷組織多呈淡黃色，組織致密，中黑麥6 號(hào)有17.52%的愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中提前出芽（圖3a），CM-Z2 在誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d時(shí)沒有愈傷組織提前出芽（圖3b），中藍(lán)麥1 號(hào)有3.35%愈傷組織提前出芽（圖3c），提前出芽的愈傷組織大多呈半透明、水浸狀，且結(jié)構(gòu)疏松。光學(xué)顯微鏡分別觀察中黑麥6 號(hào)的胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織，發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織細(xì)胞呈卵圓形，排列較整齊且緊密（圖3d），非胚性愈傷組織細(xì)胞形態(tài)及排列不規(guī)則且松散（圖3e）。

圖2 基因型和誘導(dǎo)天數(shù)對胚芽率的影響

圖3 彩色小麥成熟胚誘導(dǎo)14 d 時(shí)的愈傷組織

2.3 培養(yǎng)基和基因型對彩色小麥分化的影響

2.3.1 IAA 和KT 不同濃度、配比對彩色小麥分化的影響 由表2 可知，中黑麥6 號(hào)在3 組IAA 和KT 不同濃度、配比培養(yǎng)基中分化率、褐變率均無顯著差異（P＞0.05），但綠芽誘導(dǎo)率和成苗率在不同培養(yǎng)基中存在顯著差異（P＜0.05）；CM-Z2 在IAA 和KT不同濃度、配比培養(yǎng)基中分化率、綠芽誘導(dǎo)率和成苗率均存在顯著差異（P＜0.05）；中藍(lán)麥1 號(hào)在IAA 和KT 不同濃度、配比培養(yǎng)基中分化率和成苗率均無顯著差異（P＞0.05），但綠芽誘導(dǎo)率和褐變率在不同培養(yǎng)基中均存在顯著差異（P＜0.05）。在0.5 mg/L IAA 和4.0 mg/L KT 處理下（A-3），中黑麥6 號(hào)、CM-Z2、中藍(lán)麥1 號(hào)的分化率、綠芽誘導(dǎo)率和成苗率均達(dá)到最高，說明該培養(yǎng)基較為適合彩色小麥愈傷組織分化。

表2 彩色小麥在IAA 和KT 不同濃度、配比培養(yǎng)基中的分化情況 單位：%

2.3.2 IAA 和6-BA 不同濃度、配比對彩色小麥分化的影響 由表3 可知，中黑麥6 號(hào)在3 組IAA 和6-BA 不同濃度、配比培養(yǎng)基中綠芽誘導(dǎo)率和成苗率存在顯著差異（P＜0.05）；CM-Z2 在IAA 和6-BA 不同濃度、配比培養(yǎng)基中分化率存在顯著差異（P＜0.05），但綠芽誘導(dǎo)率、成苗率和褐變率在不同培養(yǎng)基中無顯著差異（P＞0.05）；中藍(lán)麥1 號(hào)愈傷組織在IAA 和6-BA 不同濃度、配比培養(yǎng)基中愈傷褐變率高，綠芽誘導(dǎo)率和成苗率均較低，且不同培養(yǎng)基無顯著差異（P＞0.05）。在0.1 mg/L IAA 和0.5 mg/L 6-BA 處理下（B-1），中黑麥6 號(hào)、CM-Z2、中藍(lán)麥1 號(hào)的成苗率均達(dá)到最高，說明該培養(yǎng)基較為適合彩色小麥愈傷組織分化。

表3 彩色小麥在IAA 和6-BA 不同濃度、配比培養(yǎng)基中的分化情況 單位：%

在培養(yǎng)基A-1、A-2、A-3、B-1、B-2、B-3 條件下彩色小麥分化率從高到低依次為中黑麥6 號(hào)、CM-Z2、中藍(lán)麥1 號(hào)，且在所有培養(yǎng)基處理中中黑麥6 號(hào)的分化率均為最高，為87.68%～97.50%；在培養(yǎng)基A-1、A-2、A-3、B-1、B-2、B-3 條件下彩色小麥成苗率從高到低依次均為中黑麥6 號(hào)、CM-Z2、中藍(lán)麥1 號(hào)，最高為中黑麥6 號(hào)，成苗率在17.26%～61.73%；其次為CM-Z2，成苗率在2.27%～34.09%，各基因型在最優(yōu)培養(yǎng)基中成苗情況見圖4，中黑麥6 號(hào)成苗率顯著高于CM-Z2 和中藍(lán)麥1 號(hào)，說明基因型對彩色小麥成苗有重要影響。

圖4 彩色小麥愈傷組織在最優(yōu)培養(yǎng)基中成苗情況

3 討論與結(jié)論

愈傷誘導(dǎo)時(shí)間對小麥成熟胚的脫分化存在影響，進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)應(yīng)當(dāng)選擇合適的誘導(dǎo)時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同彩色小麥品種（系）出愈率隨誘導(dǎo)時(shí)間增加而增加，但胚性愈傷組織數(shù)隨誘導(dǎo)時(shí)間呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。此外，在脫分化階段愈傷組織的提前出芽與基因型有關(guān)，且培養(yǎng)時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致胚芽率升高。綜合出愈率和形成的愈傷組織質(zhì)量，彩色小麥誘導(dǎo)14 d 左右可以獲得質(zhì)量較好的胚性愈傷組織，過長時(shí)間培養(yǎng)難以保證愈傷組織的質(zhì)量，且14 d 的愈傷誘導(dǎo)可以省去該階段繼代培養(yǎng)過程，一定程度上降低了污染風(fēng)險(xiǎn)。張?jiān)虑俚萚14]研究表明，小麥愈傷誘導(dǎo)時(shí)間為12 d 時(shí)最佳，與本研究結(jié)果相近。陸玉建等[15]研究認(rèn)為，培養(yǎng)時(shí)間較短會(huì)導(dǎo)致愈傷組織結(jié)構(gòu)松散，培養(yǎng)28 d 最適合不定芽的誘導(dǎo)，與本研究結(jié)果不一致，推測是由于最適愈傷誘導(dǎo)時(shí)間與小麥基因型有關(guān)。

本研究中，彩色小麥成熟胚分化率、綠芽誘導(dǎo)率和成苗率隨KT 濃度增加而增加，且在4 mg/L 濃度下最佳。張?jiān)虑俚萚14]研究表明，KT 濃度較低時(shí)，分化率隨KT 濃度成正比，當(dāng)KT 濃度超過0.5 mg/L 時(shí)，分化率下降，與本研究結(jié)果不一致。周子凡等[16]研究認(rèn)為，適當(dāng)提高KT 濃度，有助于成苗率的提高，當(dāng)KT 濃度達(dá)2 mg/L 時(shí)成苗率最大。劉君等[17]研究結(jié)果表明，在添加10 mg/L KT 和0.1 mg/L IAA 的分化培養(yǎng)基中小麥京411 成熟胚的成苗率高于其他培養(yǎng)基。因此，誘導(dǎo)分化的最適培養(yǎng)基與生長調(diào)節(jié)劑種類、配比以及材料的基因型相關(guān)。

近年來的研究表明，不同基因型之間的小麥成熟胚愈傷組織分化成苗能力差異顯著，且不同的分化培養(yǎng)基有較大差異[18-20]。所以，選擇再生能力強(qiáng)的小麥基因型，針對不同的基因型篩選合適的分化培養(yǎng)基對提高小麥遺傳轉(zhuǎn)化效率有重要意義。本研究中，3 種彩色小麥成苗能力從高到低依次為中黑麥6 號(hào)、CM-Z2、中藍(lán)麥1 號(hào)，在6 種不同分化培養(yǎng)基中的平均成苗率分別為43.78%、11.91%、1.53%。中藍(lán)麥1 號(hào)在6 種培養(yǎng)基中成苗率均較低，推測與其基因型有關(guān)。中黑麥6 號(hào)和CM-Z2 在A-3 培養(yǎng)基中均有較高的成苗率，說明A-3 可以作為這兩個(gè)彩色小麥良好的再生培養(yǎng)基。此外，中黑麥6 號(hào)在含有0.1 mg/L IAA 和0.5 mg/L 6-BA（B-1）的MS 分化培養(yǎng)基中成苗率最高，達(dá)到61.73%，說明中黑麥6 號(hào)是彩色小麥遺傳轉(zhuǎn)化良好的潛在受體。本研究以彩色小麥為材料，在傳統(tǒng)小麥組織培養(yǎng)體系上對愈傷誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了改進(jìn)，根據(jù)對愈傷組織狀態(tài)的觀察減少了愈傷誘導(dǎo)過程中的繼代培養(yǎng)過程，并對分化培養(yǎng)基的生長調(diào)節(jié)劑類型、濃度、配比進(jìn)行了優(yōu)化，為彩色小麥的后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化提供了良好的供試材料和試驗(yàn)基礎(chǔ)。