張善磊，王衛(wèi)軍，呂春華，劉曉飛，賴尚科，崔小平

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院宿遷農(nóng)科所，江蘇宿遷 223800）

小麥赤霉病（fusarium head blight，F(xiàn)HB）是由禾谷鐮刀菌［Fusarium graminearum Schwabe.，有性態(tài)Gibberella zeae（Schwein.）Petch］等多種鐮刀菌引起的小麥真菌性病害，給世界小麥生產(chǎn)和糧食安全造成嚴(yán)重威脅[1-3]。此外，隨著小麥籽粒灌漿成熟，赤霉病菌產(chǎn)生脫氧雪腐鐮孢菌烯醇（deoxynivalenol，DON），雪腐鐮孢菌烯醇（nivalenol，NIV），玉米赤霉烯酮（zearalenol，ZEN）等多種毒素，導(dǎo)致病粒帶毒，為害人畜健康[1]。

江蘇淮北地處黃淮地區(qū)，主要種植半冬性小麥，常年種植面積1.3×106hm2左右，占糧食作物的40%，是全省小麥的主產(chǎn)區(qū)和高產(chǎn)區(qū)，對(duì)保障江蘇省糧食安全舉足輕重[4]。近年來(lái)，該區(qū)域連年出現(xiàn)局部地區(qū)赤霉病重發(fā)、流行的現(xiàn)象，2010年、2012年和2015年發(fā)生尤為嚴(yán)重[5-7]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，上述3年的發(fā)病面積均占種植面積的1/3 以上，對(duì)小麥的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。隨著小麥基因組學(xué)研究的深入和分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，迄今至少有100 個(gè)抗赤霉病位點(diǎn)被報(bào)道，抗病基因Fhb1 和Fhb7 已被成功克隆并開(kāi)發(fā)出診斷性分子標(biāo)記，為利用分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)、快速培育抗性品種防治病害的發(fā)生流行提供了可能[8-11]。

Fhb1 是位于小麥3B 染色體短臂上的一個(gè)赤霉病主效抗病基因，抗性強(qiáng)且穩(wěn)定。徐婷婷等[12]研究發(fā)現(xiàn)，含有Fhb1 抗病基因及其基因組合的品種（系）具有較低的病情指數(shù)；張宏軍等[13]研究發(fā)現(xiàn)，含有Fhb1 基因家系的平均病情指數(shù)較不含有Fhb1 基因家系低4.0；蔣正寧等[14]研究發(fā)現(xiàn)，含有Fhb1 抗病等位基因的品種（系），病小穗數(shù)顯著低于感病等位基因品種，證明該基因與赤霉病抗性相關(guān)，具有重要育種價(jià)值。Fhb7 是來(lái)源于小麥近緣植物長(zhǎng)穗偃麥草的一個(gè)抗病基因。KIM 等[15]對(duì)小麥-長(zhǎng)穗偃麥草的7el2-7D 代換系進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)該基因高抗赤霉?。籊UO 等[16]和ZHANG 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，含有Fhb7 抗病基因材料的平均病小穗數(shù)較感病材料低，可解釋赤霉病抗性表型的30.46%；WANG 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，不同遺傳背景的小麥品種中導(dǎo)入Fhb7 基因能同時(shí)提高對(duì)赤霉病和莖基腐病的抗性水平，具有廣譜解毒功能，且不影響產(chǎn)量。如果它們?cè)诎攵孕←溈钩嗝共∮N中加以利用，將大大提高抗性品種選育效率。本研究利用赤霉病抗性基因Fhb1 的診斷性標(biāo)記和Fhb7 的顯性標(biāo)記，對(duì)155 份小麥新品系進(jìn)行基因型檢測(cè)，旨在明確其在江蘇省淮北小麥中的分布情況，為進(jìn)一步擴(kuò)大使用這些抗性基因，選育新的抗赤霉病小麥品種提供有益信息。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料包括2017—2020年江蘇省淮北小麥預(yù)備試驗(yàn)新品系155 份，2017—2018年度61 份、2018—2019年48 份、2019—2020年度46 份。攜帶赤霉病抗性基因Fhb1 的蘇麥3 號(hào)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提供，望水白由江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)和利用平臺(tái)提供。所有供試材料種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院宿遷農(nóng)科所泗陽(yáng)試驗(yàn)基地，常規(guī)栽培方式管理。

1.2 小麥基因組DNA 提取和引物合成

小麥分蘗盛期采集不同材料的新鮮葉片，采用CTAB 法提取基因組DNA[18]，使用核酸分析儀檢測(cè)DNA 提取質(zhì)量。利用朱展望等[10]設(shè)計(jì)的小麥赤霉病主效抗性基因Fhb1 的診斷性分子標(biāo)記His3B-4 和WANG 等[11]設(shè)計(jì)的小麥赤霉病主效抗性基因Fhb7的顯性分子標(biāo)記，對(duì)155 份江蘇省淮北小麥新品系進(jìn)行基因型檢測(cè)，引物序列和目標(biāo)擴(kuò)增片段大小見(jiàn)表1。引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

表1 用于赤霉病抗性基因檢測(cè)的引物

1.3 PCR 擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳

20 μL 的PCR 反應(yīng)總體系包含：ddH2O 14.4 μL，模板DNA（10 ng/μL）2.0 μL，10×Buffer（25.0 mmol/L）2.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L）0.4 μL，正反向引物（10.0 μmol/L）各0.4 μL，Taq DNA 聚合酶（2.0 U/μL）0.4 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58～65 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸90 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳分離，DuRed 核酸燃料染色后，在紫外凝膠成像儀上觀察記載。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性基因Fhb1 和Fhb7 的分子檢測(cè)

利用小麥赤霉病抗性基因Fhb1 和Fhb7 的分子標(biāo)記，對(duì)155 份江蘇淮北小麥新品系進(jìn)行基因型檢測(cè)，F(xiàn)hb1 基因標(biāo)記在含有抗病等位基因的材料中能擴(kuò)增出1 309 bp 左右的預(yù)期條帶，此外其他帶型為fhb1 感病等位基因型（圖1a、表2）；Fhb7 基因標(biāo)記為顯性標(biāo)記，該標(biāo)記在含有抗病等位基因的材料中能擴(kuò)增出892 bp 的預(yù)期條帶，而在不含有該基因的材料中無(wú)此帶型，記為fhb7 感病等位基因型（圖1b、表2）。

表2 Fhb1 和Fhb7 基因在155 份江蘇淮北小麥新品系中的分布

圖1 部分小麥新品系中Fhb1 和Fhb7 基因檢測(cè)結(jié)果

2.2 Fhb1 和Fhb7 基因在155 份江蘇淮北小麥新品系中的分布

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，155 份小麥新品系中，有4 份含有抗病基因Fhb1，所占比例為2.6%；其余151 份為感病等位基因fhb1，所占比例為97.4%。檢測(cè)到1 份材料含有抗病基因Fhb7，所占比例為0.6%；154 份含有感病等位基因fhb7，所占比例為99.4%。從基因組合分布來(lái)看，fhb1/fhb7 的分布頻率最高，為97.4%；含F(xiàn)hb1/fhb7 基因組合的品系次之，有3 份，所占比例為1.9%；分布頻率最低的組合為fhb1/Fhb7，同時(shí)含有2 個(gè)抗性基因的Fhb1/Fhb7 基因型品系只有1 份，所占比例為0.7%（表3）。這表明Fhb1 和Fhb7 抗性基因在現(xiàn)有淮北小麥新品系中的分布較少，可進(jìn)一步擴(kuò)大這2 個(gè)抗性基因的使用，提高育成品種的赤霉病抗性水平。

表3 小麥新品系中抗性基因Fhb1 和Fhb7 不同基因型的分布

2.3 單基因及不同基因組合在不同年度淮北小麥新品系中的分布

根據(jù)上述檢測(cè)結(jié)果，對(duì)供試小麥新品系進(jìn)行3 個(gè)年度劃分，分別統(tǒng)計(jì)抗性基因及其基因組合的年度間分布特點(diǎn)。2017—2018年，61 份小麥新品系中未檢測(cè)到含有Fhb1 或Fhb7 抗病等位基因的材料，在基因型分布上以fhb1/fhb7 感病等位基因組合形式存在。2018—2019年，48 份小麥新品系中檢測(cè)到含有Fhb1 和Fhb7 抗病基因的材料分別為2 份和1 份，所占比例分別為4.2%和2.1%；同時(shí)含有2 個(gè)抗病基因的材料有1 份，所占比例為2.1%。2019—2020年度，46 份小麥新品系中檢測(cè)到含有Fhb1 抗病等位基因的材料有2 份，所占比例為4.3%；未檢測(cè)到含有Fhb7 抗病等位基因的材料；在基因組合中含fhb1/fhb7 的品系數(shù)較多，所占比例為95.7%，而其他3 種有利基因組合的年度間變幅并不明顯（表4）。

表4 不同年份小麥新品系中Fhb1 和Fhb7 基因分布

表2（續(xù)）

3 討論與結(jié)論

小麥赤霉病是極具毀滅性且防治困難的真菌性病害，是農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的世界性難題，嚴(yán)重威脅我國(guó)小麥產(chǎn)業(yè)發(fā)展[19]。長(zhǎng)期的生產(chǎn)實(shí)踐證明，小麥抗赤霉病品種的選育和利用是防治該病流行危害的經(jīng)濟(jì)有效措施。然而，傳統(tǒng)小麥抗赤霉病育種是在充分發(fā)病的前提下，依據(jù)植株病害發(fā)生程度進(jìn)行選擇，不僅耗時(shí)費(fèi)力而且易受環(huán)境影響，準(zhǔn)確性差。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和基因組學(xué)研究的深入，我國(guó)科學(xué)家在小麥抗赤霉病基因克隆和功能分析等方面取得了重大進(jìn)展。Fhb1 是最早發(fā)現(xiàn)于我國(guó)小麥品種蘇麥3號(hào)中的一個(gè)持久、穩(wěn)定抗性基因，是目前公認(rèn)的赤霉病抗性效應(yīng)最大的位點(diǎn)。LI 等[9]和SU 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，該基因編碼一個(gè)富含組氨酸的鈣離子結(jié)合蛋白（histidine-rich calcium-binding protrin，His），是我國(guó)特有的優(yōu)異小麥基因資源。Fhb7 源于長(zhǎng)穗偃麥草7E 染色體長(zhǎng)臂末端，是通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交轉(zhuǎn)移至栽培小麥中的一個(gè)高效抗赤霉病基因[16]。WANG 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，該基因編碼一種谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST），能夠打開(kāi)嘔吐毒素的環(huán)氧基因，并催化形成谷胱甘肽加合物，從而產(chǎn)生解毒效應(yīng)。不僅如此，F(xiàn)hb1 和Fhb7 基因即使在不同遺傳背景條件下，也能有效提升小麥對(duì)赤霉病的抗性水平，具有廣譜抗性。

為提高Fhb1 和Fhb7 基因的選擇效率，已有研究人員設(shè)計(jì)出不同類型的分子標(biāo)記篩選其抗病基因型，并鑒定出一批攜帶目標(biāo)基因的優(yōu)異材料，減少了小麥抗赤霉病育種的盲目性。本研究利用Fhb1 和Fhb7 的基因標(biāo)記，對(duì)155 份小麥新品系進(jìn)行基因型檢測(cè)，明確這些抗性基因及基因組合在江蘇省淮北地區(qū)的利用及分布狀況。155 份小麥新品系中fhb7基因的出現(xiàn)頻率最高，為99.4%，且基因型分布中多以fhb1/fhb7 感病基因組合存在，而攜帶Fhb1 和Fhb7 抗病等位基因的材料所占比例分別為2.6%和0.7%，明顯低于其感病等位基因的分布頻率。進(jìn)一步對(duì)2017—2018年、2018—2019年和2019—2020年Fhb1、Fhb 7 基因分布狀況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與2017—2018年比較，近年這兩個(gè)抗病基因的出現(xiàn)頻率明顯提高，說(shuō)明通過(guò)遺傳育種改良突破了該抗病基因向半冬性小麥轉(zhuǎn)移的品種生態(tài)類型限制，為提升江蘇省淮北小麥的赤霉病抗性奠定了基礎(chǔ)。

受氣候變暖以及秸稈還田等耕作制度的改變影響，江蘇淮北的赤霉病害呈蔓延趨勢(shì)，2010年小麥赤霉病在蘇北沿海地區(qū)重發(fā)，為2004年以來(lái)發(fā)生最為嚴(yán)重的一年，至2020年11年中就有2010、2012年2年大流行，2014、2015、2016、2018年4年局部地區(qū)偏重發(fā)生[21-25]。王震等[26]對(duì)江蘇省北部14 個(gè)主栽小麥品種的赤霉病抗性進(jìn)行鑒定，結(jié)果在單花滴注條件下僅有2 個(gè)達(dá)到中感水平；常蕾等[27]對(duì)97 份小麥高代品系進(jìn)行赤霉病抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)56 份淮北品系中，僅有5 份達(dá)到中感及以上水平。本研究中155 份小麥新品系僅檢測(cè)到4 份含有Fhb1 抗性基因的材料，1 份含有Fhb7 抗性基因的材料，可見(jiàn)該區(qū)域小麥抗赤霉病育種形勢(shì)仍然嚴(yán)峻，要充分利用好現(xiàn)有抗病基因，不斷挖掘新的優(yōu)異基因和抗源材料，通過(guò)常規(guī)育種手段結(jié)合分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的直接選擇和高效聚合，從而快速、有效提升育成品種的赤霉病抗性水平，促進(jìn)淮北小麥的生產(chǎn)發(fā)展，保障江蘇省糧食安全。