楊資冬，程逸文，張振興，吳昊天，王成強(qiáng)，陳巧玲，陳 思，滿初日嘎

（1.海南大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)試驗(yàn)室 海口 570228;2.海南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 ?？?570228）

鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）是一種糖不發(fā)酵的革蘭氏陰性菌[1-3]。在電鏡下，鮑曼不動(dòng)桿菌大小為(600～ 1 000 nm)×(1 000～ 1 600 nm)，正常外形呈球桿狀，兩端鈍圓，但是在培養(yǎng)基中常常是以桿狀形態(tài)存在。鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)溫度的敏感度較低，可在19 ℃～ 43 ℃大量繁殖，最適生存溫度為37 ℃，氣溫過高時(shí)會(huì)異常滋長(zhǎng)[4-5]。鮑曼不動(dòng)桿菌菌體常以單獨(dú)或成對(duì)形式存在于大自然和醫(yī)院環(huán)境中，在水、土壤、皮膚、腸道和生殖道中均能生存。該細(xì)菌屬于機(jī)會(huì)性致病菌，不僅感染動(dòng)物，還可通過接觸傳播感染人（如飼養(yǎng)員，獸醫(yī)等），引起嚴(yán)重的醫(yī)源性感染，如傷口感染、尿道感染、腦膜炎、敗血癥等，易在重癥監(jiān)護(hù)病房流行[6]。目前科研人員從醫(yī)院、寵物所等地發(fā)現(xiàn)不少人和動(dòng)物感染鮑曼不動(dòng)桿菌的案例，其中尤以多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌最突出，藥物治療方面較棘手，一旦感染將對(duì)畜牧業(yè)帶來一定的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)威脅人類的健康安全。國(guó)外研究人員通過近幾十年的追蹤報(bào)道發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌的感染主要分布在天氣炎熱、氣候濕潤(rùn)的地區(qū)。我國(guó)對(duì)該細(xì)菌的研究起步較晚，缺少對(duì)該病菌的耐藥性、毒力、疫苗及流行病學(xué)有關(guān)研究[7-8]，對(duì)于牛感染鮑曼不動(dòng)桿菌研究很少，僅見王孝武等[9]報(bào)道了鮑曼不動(dòng)桿菌引起牛子宮內(nèi)膜炎，葛東紅等[10]在生牛乳中發(fā)現(xiàn)了鮑曼不動(dòng)桿菌。2019 年10 月海南省某牛場(chǎng)有3 頭牛死亡，發(fā)病早期氣喘嚴(yán)重，中期伴隨著發(fā)熱，暮氣沉沉，后期無食欲，直至死亡，從病死牛的肺臟內(nèi)分離出1 株病原菌，并對(duì)其進(jìn)行生化試驗(yàn)和細(xì)菌16S rDNA 鑒定，結(jié)果證實(shí)該分離菌為鮑曼不動(dòng)桿菌。本試驗(yàn)從病死牛肺臟中分離得到鮑曼不動(dòng)桿菌菌株通過16S rDNA 及生化鑒定等方法確定致病菌遺傳背景，同時(shí)測(cè)定該致病菌對(duì)小鼠的半數(shù)致死量及其藥物敏感性，旨在為預(yù)防感染鮑曼不動(dòng)桿菌和感染鮑曼不動(dòng)桿菌的治療提供理論依據(jù)[11]。

1 材料與方法

1.1 病料海南省東方市某牛場(chǎng)病死牛的肺臟。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6 周齡昆明（KM）小鼠，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.3 試驗(yàn)試劑胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth,TSB）培養(yǎng)基和胰胨蛋白胨酵母膏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（tryptone-peptone-yeast extract-glucose agar，TPYG agar），購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基（MacConkey medium），購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；藥敏試紙，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；生化鑒定管，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.4 細(xì)菌的分離和染色在無菌環(huán)境下采集病死牛肺臟組織樣，涂布于胰胨蛋白胨酵母膏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（含5% 綿羊脫纖血）血平板和麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上。對(duì)菌群進(jìn)行染色觀察并從中挑選單一菌落，37 ℃下在胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）中培養(yǎng)12 h，然后劃線于胰胨蛋白胨酵母膏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（含5%綿羊脫纖血）血平板進(jìn)行分離培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間觀察菌落生長(zhǎng)情況。取單克隆菌落進(jìn)行革蘭氏染色。

1.5 細(xì)菌16S rDNA 序列分析參照文獻(xiàn)[12]中細(xì)菌16S rDNA 通用引物序列，將本實(shí)驗(yàn)分離菌株送公司合成，通過PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物電泳試驗(yàn)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。在基因庫(kù)（gene bank）中對(duì)該菌株16S rDNA 序列進(jìn)行同源性分析，鑒定細(xì)菌的種屬。按照試劑盒說明書提取細(xì)菌DNA。

1.6 分離菌株生化反應(yīng)鑒定參考伯杰手冊(cè)中細(xì)菌生理生化鑒定方法[13]，將分離的菌株置于尿素酶、氧化酶、靛基質(zhì)、甘露醇、接觸酶、麥芽糖、乳糖及葡萄糖等生化鑒定管內(nèi)，反應(yīng)24 h 之后觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.7 動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)將分離培養(yǎng)后的鮑曼不動(dòng)桿菌接種于胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)9 h，然后在胰胨蛋白胨酵母膏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。用無菌磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）調(diào)整含菌量為2.5×107、5×107、1×108、2×108、4×108CFU·mL-1。36 只試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成6 組，每組6 只，第1 組為空白組，第2～ 6 組為試驗(yàn)接種組。接種方式為腹腔內(nèi)注射，試驗(yàn)組分別注射5 個(gè)不同劑量(2.5×107、5×107、1×108、2×108、4×108CFU·mL-1)的菌液各200 μL，空白組注射等量無菌PBS，每天接種1 次，連續(xù)接種7 d。每天定時(shí)觀察并記錄試驗(yàn)小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)、發(fā)病狀況及死亡數(shù)量。對(duì)試驗(yàn)中死亡的小鼠進(jìn)行剖檢。根據(jù)公式計(jì)算LD50[14-15]。

式中，Xm：最大劑量的對(duì)數(shù)值；i：相鄰兩劑量組對(duì)數(shù)值的差；∑p：各劑量組死亡率的總和。

1.8 藥物敏感性試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法。將鮑曼不動(dòng)桿菌作為指示菌培養(yǎng)于含有5% 胎牛血清的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，將頭孢氨芐、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等常用抗生素的藥敏紙片置于含指示菌的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌環(huán)直徑（mm）。藥敏片距離≥25 mm。遵照國(guó)際檢測(cè)準(zhǔn)則記錄試驗(yàn)結(jié)果[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離培養(yǎng)與染色結(jié)果從病死牛體內(nèi)分離出的病原菌放在胰胨蛋白胨酵母膏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)的結(jié)果見圖1。從圖1 可見，菌落呈淡白色，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，多以單個(gè)或成對(duì)菌落存在，有些菌落凸起，透明度很低，不溶血。由病死牛肺臟制成的切片，在顯微鏡下可見多數(shù)菌體呈短桿狀，無鞭毛。病原菌革蘭氏染色呈陰性（圖2）與不動(dòng)桿菌特性相符，初步證實(shí)該病原菌分離株為牛源鮑曼不動(dòng)桿菌。

圖1 菌落體外培養(yǎng)結(jié)果Fig.1 Results of in vitro culture of colonies

圖2 分離株革蘭氏染色結(jié)果 10×100Fig.2 Gram staining results of isolates

2.2 細(xì)菌16S rDNA 序列分析結(jié)果采用16S rDNA引物對(duì)分離的單一菌落進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳可見一條約1 485 bp條帶(如圖3 所示)。電泳產(chǎn)物回收后送公司測(cè)序，上傳序列至基因庫(kù)中，登錄號(hào)為（NR_117620.1）并與基因庫(kù)中鮑曼不動(dòng)桿菌序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示與鮑曼不動(dòng)桿菌同源率高達(dá)99.8%，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)分離的菌株與鮑曼不動(dòng)桿菌處于同一亞枝，親緣關(guān)系較近（圖4、圖5），進(jìn)一步證明該分離菌株為鮑曼不動(dòng)桿菌。

圖3 分離株16S rDNA PCR 產(chǎn)物Fig.3 The 16S rDNA PCR product of the isolate M：D2000 DNA Marker

圖4 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic evolutionary tree

圖5 同源性分析Fig.5 Homology analysis

2.3 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果遵循生化反應(yīng)試劑盒中的說明書對(duì)病原菌進(jìn)行生化鑒定。結(jié)果(表1)表明，分離株的氧化酶陰性，接觸酶陽性；分離株利用葡萄糖做碳源；麥芽糖、乳糖、MR 及VP 均呈陰性，鳥氨酸、尿素酶、半乳糖、枸櫞酸鹽和葡萄糖等呈陽性，與伯杰手冊(cè)中的報(bào)道基本相符。結(jié)合16S rDNA 鑒定結(jié)果可以證實(shí)本實(shí)驗(yàn)分離株為鮑曼不動(dòng)桿菌。

表1 鮑曼不動(dòng)桿菌分離株的生化鑒定結(jié)果Tab.1 Biochemical identification of Acinetobacterbaumannii isolates

2.4 動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照組小鼠狀態(tài)良好，接種細(xì)菌組小鼠食欲減退，活動(dòng)減緩，精神萎靡，后期出現(xiàn)呼吸急促、氣喘，身體蜷縮，直至死亡。取發(fā)病小鼠的肺組織，于TSA 培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)8 h，生理生化及細(xì)菌生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果與分離株各試驗(yàn)指標(biāo)基本一致，鑒定本實(shí)驗(yàn)分離的病原菌為鮑曼不動(dòng)桿菌[17]。

2.5 半數(shù)致死量（LD50）測(cè)定結(jié)果分離株感染試驗(yàn)組小鼠結(jié)果為通過對(duì)小鼠腹腔內(nèi)注射細(xì)菌劑量為5×107CFU·mL-1組小鼠在48 h 死亡2 只；1×108CFU·mL-1組小鼠在48h死亡3只；2×108CFU·mL-1組小鼠在48h死亡5只；4×108CFU·mL-1組小鼠在48h內(nèi)全部死亡。2.5×107CFU·mL-1組小鼠在48 h 內(nèi)無死亡。試驗(yàn)組小鼠腹腔注射LD50為8.89×107CFU·mL-1。

2.6 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果藥敏性鑒定結(jié)果見表2。根據(jù)藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)，該株鮑曼不動(dòng)桿菌分離株對(duì)青霉素、頭孢他啶、苯唑青霉素、氨芐青霉素、頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢拉定、麥迪霉素耐藥，對(duì)羧芐青霉素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星敏感。這表明此分離株的耐藥能力高，在上述藥物鑒定試驗(yàn)中該牛源鮑曼不動(dòng)桿菌沒有高敏藥物，僅有3 種敏感藥物可用于治療。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of drug sensitivity test

3 討論

國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果表明，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多數(shù)抗生素藥物不敏感，僅有部分抗生素藥物可用于治療，但是效果不甚滿意，耐藥形勢(shì)十分嚴(yán)峻[18]。其中劉勃興等[19]人從某雞場(chǎng)分離出的1 株鮑曼不動(dòng)桿菌僅對(duì)諾氟沙星表現(xiàn)中敏，對(duì)其他抗生素均不敏感，但是諾氟沙星是獸用禁藥，該菌株面臨著無藥可用的局面，應(yīng)引起重視。

近些年來，多重耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌在臨床細(xì)菌分離率占據(jù)前三，已經(jīng)變?yōu)橐环N日益重要的病原體，對(duì)該病菌的研究具有一定的公共衛(wèi)生學(xué)意義[20]。國(guó)內(nèi)外對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性能力研究較多，主要與細(xì)菌內(nèi)含有的氨基修飾酶、β內(nèi)酰胺酶、耐藥基因島和整合子等密切相關(guān)[21]。而對(duì)于鮑曼不動(dòng)桿菌的致病機(jī)制研究較少，目前該細(xì)菌的致病機(jī)理尚不清楚，對(duì)已知的毒力因子外膜蛋白A 的研究最為透徹[22]。研究報(bào)道，多粘菌素E 作為鮑曼不動(dòng)桿菌有效的體外活性菌劑，可與多種抗生素搭配使用，效果顯著[23]。

本研究從病死牛肺臟內(nèi)分離出鮑曼不動(dòng)桿菌，在動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)中，4×108CFU·mL-1組試驗(yàn)小鼠在48 h 內(nèi)全部死亡，證明該菌具有一定的致病力。藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果顯示該株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多數(shù)抗生素表現(xiàn)耐藥，只對(duì)羧芐青霉素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星敏感。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)牛源鮑曼不動(dòng)桿菌的報(bào)道尤其對(duì)其致病性的研究報(bào)道較少。隨著我國(guó)牛養(yǎng)殖規(guī)模的不斷增長(zhǎng)，鮑曼不動(dòng)桿菌感染將會(huì)成為養(yǎng)牛業(yè)的又一難題。建議加強(qiáng)養(yǎng)殖戶對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的感染預(yù)防意識(shí)，防止牛感染該菌，同時(shí)保障飼養(yǎng)人員的健康安全。