任 昊

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

1 概述

鮐魚屬于鱸形科鮐屬，體型較大，產(chǎn)量高，分布于我國(guó)各個(gè)流域，在黃海與東海分布最為廣泛，是太平洋地區(qū)最重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一[1]。鮐魚含有豐富的蛋白質(zhì)和脂肪、多種礦物質(zhì)元素鈣、磷和鐵、活性物質(zhì)核黃素、DHA和EPA。鮐魚中含有的各類活性物質(zhì)在人體的神經(jīng)、免疫和骨骼發(fā)育方面有重要作用[2-3]。鮐魚價(jià)格低廉，為了保護(hù)鮐魚相關(guān)的水產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)，研究鮐魚產(chǎn)品深加工技術(shù)成為目前急需解決的問題[4]。

多肽由20種氨基酸通過不同的排列方式組成，從二肽到多肽結(jié)構(gòu)，它的分子結(jié)構(gòu)是介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一種化合物，每一種多肽都有其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，不同的結(jié)構(gòu)形式代表其功能的不同[5-6]。常見的功能性多肽包括抗腫瘤多肽、抗疲勞多肽、抗氧化多肽、抗炎性多肽和抗菌多肽。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的功能性多肽超過1000種，多肽的使用和開發(fā)將會(huì)在我們的生活中占有不可忽視的地位[7-8]。

本研究側(cè)重于對(duì)鮐魚多肽的提取工藝進(jìn)行研究，從蛋白酶的選擇、蛋白酶的用量、pH值和最適溫度4個(gè)方面對(duì)鮐魚多肽的提取進(jìn)行優(yōu)化；同時(shí)將提取的鮐魚多肽與西洋參提取液進(jìn)行抗疲勞活性對(duì)比，研究鮐魚多肽抗疲勞活性的強(qiáng)弱。通過對(duì)鮐魚多肽提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳參數(shù)條件，為鮐魚多肽的提取工藝提供理論基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

鮐魚、胰蛋白酶、硫酸銅、酸性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、磷酸二氫鈉、牛血清、二苯基苦基、氫氧化鈉、鹽酸、雙氧水、中性蛋白酶、番紅花T、硫酸亞鐵、三氯乙酸、磷酸氫二鈉[9-10]。

2.2 儀器設(shè)備

天平、烘箱、分光光度計(jì)、水浴鍋、高速離心機(jī)、pH計(jì)、干燥機(jī)、真空泵[11]。

2.3 鮐魚多肽提取工藝優(yōu)化操作方法

2.3.1 最佳用酶的篩選方法

取少量的鮐魚肉，用粉肉機(jī)器將其粉碎，之后按照鮐魚肉的重量，加入6倍相同體重的蒸餾水，在25 ℃水浴鍋中不斷地?cái)嚢?，使蛋白酶達(dá)到最佳的酶解溫度，維持溫度10 min，再用氫氧化鈉或者鹽酸調(diào)節(jié)至最適合的pH[12-13]。將胰蛋白酶、酸性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶分別加入1000 U在5個(gè)燒杯中，同時(shí)加入1 g魚肉，充分地拌勻。在酶解的過程中，每間隔1 h取一次酶解液，然后將酶解液加熱至100 ℃左右使蛋白酶失去活性。用酸或者堿調(diào)節(jié)酶解液的pH至中性，在4 ℃的環(huán)境下離心10 min, 將上清液放置于-4 ℃的低溫環(huán)境中保存?zhèn)溆肹14]。

隨著蛋白質(zhì)水解程度的增強(qiáng)，溶液中的氨基酸含量不斷增加。因此，水解液中的氨基酸含量在一定程度上也反映了蛋白質(zhì)的水解程度，本研究采用甲醛滴定法測(cè)定蛋白質(zhì)的水解度。鮐魚多肽具有清除DPPH自由基的能力，通過測(cè)量DPPH自由基的清除率也能間接地測(cè)量鮐魚多肽的含量[15-16]。本方法中DPPH自由基的清除率參考文獻(xiàn)略做修改[17]，將5種水解酶獲得的水解產(chǎn)物分別裝入5支試管中，同時(shí)各加入1 mL濃度為50%的乙醇，最后加入濃度為0.1 mol/mL的DPPH自由基少許，搖勻，室溫放置0.5 h，在517 nm的紫外光下進(jìn)行比色。用50%的乙醇作為空白組；用50%的乙醇代替樣品作為對(duì)照組。DPPH自由基清除率利用下式進(jìn)行測(cè)定[18]。

DPPH自由基清除率(%)=1-(A樣品-A空白)/(A對(duì)照-A空白)。

式中：A樣品為5種不同水解酶的水解液；A空白為50%的乙醇替代水解液；A對(duì)照為50%的乙醇替代樣品。

2.3.2 鮐魚多肽制備的加酶量、酶解時(shí)間、溫度和pH值影響實(shí)驗(yàn)方法

影響酶解反應(yīng)的因素包括加酶量、酶解時(shí)間、溫度和pH值，每個(gè)因素的改變都會(huì)影響酶解產(chǎn)物的組成和酶的生物活性，所以，通過對(duì)單因素的分析，同時(shí)以DPPH自由基清除率作為指標(biāo)，篩選出適合鮐魚多肽制備的最優(yōu)條件[19]。

2.4 鮐魚多肽抗疲勞活性研究操作方法

3組小鼠分別是飼喂無(wú)菌水作為空白組，飼喂西洋參作為對(duì)照組，飼喂鮐魚多肽作為實(shí)驗(yàn)組。飼喂完小鼠30 min后，在小鼠的尾部負(fù)重10%的體重鉛條，將小鼠放置于25 ℃左右的恒溫箱中，恒溫箱水深為50 cm，直至小鼠沉入水中30 s不再上浮，視為力竭死亡，記錄時(shí)間為將小鼠放置于恒溫箱至小鼠死亡時(shí)間，作為小鼠力竭游泳時(shí)間[20-21]。

3 鮐魚多肽的提取工藝優(yōu)化

3.1 5種水解蛋白酶的篩選

由圖1可知，水解度最高的為中性蛋白酶，水解度為20.2%，其次依次為風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶，水解度分別為18.1%、10.0%、8.0%和5.0%；DPPH自由基清除率中性蛋白酶達(dá)到50%，在本實(shí)驗(yàn)中達(dá)到了最高，其次是風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和酸性蛋白酶，DPPH自由基清除率分別為45%、32%、30%和25%。中性蛋白酶在水解度和DPPH自由基清除率方面均為最高，所以，以中性蛋白酶作為最佳用酶進(jìn)行鮐魚多肽的制備和抗疲勞活性研究。

圖1 5種蛋白酶水解鮐魚多肽的水解度及活性測(cè)定Fig.1 The hydrolysis degree and activity determination of peptides from Scomber japonicus hydrolyzed by five kinds of proteases

3.2 加酶量對(duì)DPPH自由基清除率的影響

在鮐魚肉中加入其重量10倍的純凈水，選用上述實(shí)驗(yàn)中的最優(yōu)水解蛋白酶中性蛋白酶作為水解酶，調(diào)節(jié)中性蛋白酶的濃度分別為800，1000，1200，1400，1600，1800 U/g。

由圖2可知，當(dāng)中性蛋白酶濃度低于1600 U/g時(shí)，DPPH自由基清除率隨著中性蛋白酶濃度的增加而增加；當(dāng)中性蛋白酶濃度高于1600 U/g時(shí)，隨著加酶量的增加，DPPH自由基清除率明顯下降。所以1600 U/g為最佳的加酶量，此研究結(jié)果也與之前研究者的研究結(jié)果相同[22-23]。

圖2 加酶量對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.2 The effect of the additive amount of enzyme on the scavenging rate of DPPH free radicals

3.3 pH對(duì)DPPH自由基清除率的影響

在鮐魚肉中加入其重量10倍的純凈水，選用上述實(shí)驗(yàn)中的最優(yōu)水解蛋白酶中性蛋白酶作為水解酶，使用鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)節(jié)水解液的pH值分別為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0。

由圖3可知，當(dāng)水解液中的pH值低于7.0時(shí)，DPPH自由基清除率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，當(dāng)pH值大于7.0時(shí)，DPPH自由基清除率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。當(dāng)水解液中pH值為7.0時(shí)，中性蛋白酶對(duì)DPPH自由基的清除率為70%，是整個(gè)實(shí)驗(yàn)中最大的清除率，其次是pH為6.0，8.0，5.0，9.0，對(duì)DPPH自由基的清除率分別為60%、60%、50%、50%，所以選擇pH 7.0作為鮐魚多肽提取的最佳pH值。

圖3 pH對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.3 The effect of pH value on the scavenging rate of DPPH free radicals

3.4 溫度對(duì)DPPH自由基清除率的影響

在鮐魚肉中加入其重量10倍的純凈水，選用上述實(shí)驗(yàn)中的最優(yōu)水解蛋白酶中性蛋白酶作為水解酶，設(shè)置酶解溫度為30，40，50，60，70 ℃。

由圖4可知，不同的溫度，中性蛋白酶對(duì)DPPH自由基的清除率不同，當(dāng)中性蛋白酶的酶解溫度為40 ℃時(shí)，中性蛋白酶對(duì)DPPH自由基的清除率最高，清除率為70%；當(dāng)溫度大于40 ℃時(shí)，DPPH自由基清除率隨著溫度的升高而降低；當(dāng)溫度小于40 ℃時(shí)，DPPH自由基清除率隨著溫度的升高而升高，該實(shí)驗(yàn)中最優(yōu)的鮐魚多肽提取溫度為40 ℃。

圖4 溫度對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.4 The effect of temperature on the scavenging rate of DPPH free radicals

4 鮐魚多肽抗疲勞活性研究

機(jī)體的疲勞體現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)耐力的下降，在運(yùn)動(dòng)的過程中，肌肉對(duì)耗氧量、血糖和蛋白質(zhì)的消耗增加，導(dǎo)致疲勞現(xiàn)象的產(chǎn)生，運(yùn)動(dòng)能力的強(qiáng)弱能夠直接反映機(jī)體的疲勞程度。本實(shí)驗(yàn)選用小鼠游泳實(shí)驗(yàn)對(duì)鮐魚多肽的抗疲勞活性進(jìn)行研究。

由圖5 可知，3種物質(zhì)在相同濃度的條件下，鮐魚多肽的抗疲勞活性最強(qiáng)，小鼠力竭游泳時(shí)間為70 min，其次為西洋參的抗疲勞活性，小鼠力竭游泳時(shí)間為45 min。

圖5 3種不同的抗疲勞活性物質(zhì)對(duì)小鼠力竭時(shí)間的影響Fig.5 The effect of three different anti-fatigue active substances on exhaustion time of mice

5 結(jié)論

通過本研究可以得出：鮐魚多肽提取的最佳技術(shù)參數(shù)為鮐魚的水解蛋白酶為中性蛋白酶，添加的酶濃度為1600 U/g，pH值為7.0，溫度為40 ℃。鮐魚多肽的抗疲勞活性高于西洋參提取物的抗疲勞活性。

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們的生活節(jié)奏快，長(zhǎng)時(shí)間處于較高壓力和超負(fù)荷的工作量環(huán)境下，人們極易產(chǎn)生疲勞，機(jī)體的疲勞又易導(dǎo)致各類疾病的產(chǎn)生。我們無(wú)法改變生活壓力，但是可以通過借助各種各樣具有抗疲勞功效的保健品和藥物來緩解機(jī)體疲勞。我國(guó)的抗疲勞產(chǎn)品來源廣泛，很多研究人員從食用菌中獲得抗疲勞活性的物質(zhì)：金耳[24]、靈芝、羊肚菌；天然植物：山藥、人參；水果：藍(lán)莓、蘋果以及魚類或一些海洋生物身體內(nèi)具有一些抗疲勞功效的活性肽。鮐魚多肽作為以后抗疲勞活性物質(zhì)進(jìn)行開發(fā)和利用具有廣闊的市場(chǎng)前景。