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        低共熔溶劑協(xié)同超聲波提取紅棗中總黃酮的研究

        2022-01-11 09:44:42王小佳于有偉崔美林鄭朋凱張少穎
        中國調(diào)味品 2022年1期
        關(guān)鍵詞:中總膽堿乙二醇

        王小佳,于有偉,崔美林,鄭朋凱,張少穎

        (山西師范大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,山西 臨汾 041004)

        紅棗是鼠李科棗屬植物棗樹的果實,富含氨基酸、糖類、礦物質(zhì)、維生素、黃酮類等成分。紅棗屬于藥食同源的食品原料,醫(yī)療保健價值極高,具有保護肝臟和養(yǎng)胃健脾等功效[1]。紅棗產(chǎn)業(yè)是山西省的特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)之一,在鄉(xiāng)村振興中具有重要作用。近幾年紅棗生產(chǎn)供大于求,價格低迷,造成滯銷[2]。黃酮類化合物 (flavonoids)是泛指具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)的一系列化合物,是由兩個苯環(huán)通過三碳相互連接而成的(見圖1)[3],紅棗中含有豐富的黃酮類化合物。許多研究表明,黃酮類化合物有多種生物活性,能消除人體內(nèi)積累的自由基,從而防止細(xì)胞的衰老,防止癌癥的發(fā)生。黃酮還可以降低膽固醇,降低血壓,除去血垢,軟化血管,防止心血管病的發(fā)生。除此之外,黃酮能殺滅細(xì)菌,清熱解毒,抗炎,消腫,促進(jìn)傷口愈合和止痛,改善腎功能等[4]。

        圖1 黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)示意圖

        低共熔溶劑是由一定化學(xué)計量比的氫鍵受體(如季銨鹽)和氫鍵供體(如酰胺、羧酸和多元醇等化合物)組成的低共熔混合物,是一種綠色溶劑,它的凝固點遠(yuǎn)低于其組成成分純物質(zhì)的熔點,又被人們稱為離子液體類似物。但它比離子液體更易制備,價格較低,毒性小,不容易揮發(fā),溶解性比較好,因此在混合物分離的領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛[5]。超聲波能加速浸提的成分從原料向溶劑擴散,被廣泛應(yīng)用到功能成分的提取方面[6]。本試驗以紅棗為原料,用低共熔溶劑協(xié)同超聲波提取紅棗中的總黃酮化合物,對紅棗原料進(jìn)行深度開發(fā)。本研究在一定程度上可以緩解紅棗賣果難的問題,對于棗業(yè)的發(fā)展具有重要的參考意義;同時,所提取的黃酮是一種源于水果的營養(yǎng)功效非常高的天然成分,在食品行業(yè)具有非常高的潛在應(yīng)用價值。

        1 材料與方法

        1.1 材料和試劑

        紅棗:稷山板棗,購于臨汾市堯豐農(nóng)貿(mào)市場;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品:優(yōu)級純,購自中國藥品生物制品檢定所;檸檬酸、亞硝酸鈉、乙醇:均為分析純,購于天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;氫氧化鈉、硝酸鋁、氯化膽堿:均為分析純,購于山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        752N紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;JY92-IIDN超聲波細(xì)胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;H1850R臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;GZX-9246數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;ISO-9001電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;WBL25B26攪拌料理粉碎機 廣東美的電器股份有限公司。

        1.3 低共熔溶劑的制備

        將組成摩爾比為1∶2的氯化膽堿/檸檬酸、氯化膽堿/蔗糖、氯化膽堿/乙二醇、氯化膽堿/丙三醇、氯化膽堿/乳酸分別置于燒杯中,采用磁力攪拌器在100 ℃下攪拌加熱,直至形成澄清、均一的溶液,隨后冷卻至室溫備用[7]。

        1.4 紅棗樣品中總黃酮的提取

        選取稷山板棗,人工去核,然后將去核后的棗放入干燥箱中60 ℃下烘干[8]。隨后放入攪拌機中粉碎,過60目篩,得到紅棗粉末。準(zhǔn)確稱取紅棗粉1 g置于50 mL具塞三角瓶中,加入一定量的不同稀釋比例的低共熔溶劑。采用不同功率的超聲波在60 ℃下提取一定時間,然后將提取液采用5000 r/min離心15 min,取上清液,測定總黃酮含量。

        1.5 試驗設(shè)計

        試驗首先篩選低共熔溶劑體系,然后確定遴選的低共熔溶劑體系組成比例。隨后考察低共熔溶劑稀釋倍數(shù)等幾個提取因素對黃酮得率的影響,并進(jìn)行正交試驗優(yōu)化,得出最佳提取條件。

        1.6 總黃酮的測定

        采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法,以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)對照品,參照李利華的方法進(jìn)行測定[9]。準(zhǔn)確稱取蕓香葉苷20 mg于燒杯中,并加60%乙醇溶液溶解,然后用玻璃棒移至100 mL容量瓶中。用60%乙醇溶液分次洗滌燒杯并移入容量瓶后,定容,即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0 mL,移入10 mL容量瓶中,分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL,搖勻后放5 min。再加入10%硝酸鋁溶液0.4 mL,搖勻放6 min。最后加入4%的氫氧化鈉溶液4 mL,定容至10 mL,搖勻放15 min。用60%乙醇溶液作為參比溶液,在波長510 nm處測定其吸光度值。取提取液離心后的上清液,經(jīng)過相同的顯色過程,測吸光值。代入回歸方程,按照下列公式計算總黃酮的含量。

        式中:X為樣品液所測吸光值對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度(mg/50 mL);V為樣品液體積,mL;N為稀釋倍數(shù);m為提取樣品的質(zhì)量,g。

        1.7 統(tǒng)計分析

        試驗各處理重復(fù)3次,采用DPS 7.05進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,多重比較采用Duncan's新復(fù)極差法。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        由圖2可知,蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=9.6248x-0.0254(R2=0.9999),且在0~2 mg/50 mL內(nèi)存在良好的線性關(guān)系。

        圖2 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線

        2.2 低共熔溶劑體系種類的篩選

        稱取紅棗粉1 g置于50 mL具塞三角瓶中,分別加入稀釋30倍,組成摩爾比為1∶2的氯化膽堿/檸檬酸、氯化膽堿/蔗糖、氯化膽堿/乙二醇、氯化膽堿/丙三醇、氯化膽堿/乳酸各20 mL,在60 ℃超聲100 W條件下提取30 min。由圖3可知,在氯化膽堿/檸檬酸、氯化膽堿/蔗糖、氯化膽堿/乙二醇、氯化膽堿/丙三醇、氯化膽堿/乳酸5種低共熔溶劑體系中,氯化膽堿/乙二醇對紅棗總黃酮的提取率最高(P<0.05)。氯化膽堿/丙三醇的提取率也比較高,提取率最低的是氯化膽堿/檸檬酸體系。因此在接下來的試驗中,選取氯化膽堿和乙二醇所制備的低共熔溶劑提取紅棗中的總黃酮。

        圖3 不同低共熔溶劑體系對紅棗總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of different deep eutectic solvent systems on the extraction rate of total flavonoids from red jujube

        2.3 低共熔溶劑稀釋倍數(shù)

        稱取紅棗粉1 g置于50 mL具塞三角瓶中,分別加入稀釋倍數(shù)為1,10,20,30,40倍且組成摩爾比為1∶2的氯化膽堿/乙二醇20 mL,在60 ℃超聲100 W條件下提取30 min。由圖4可知,氯化膽堿/乙二醇低共熔溶劑體系從1倍稀釋到10倍時,提取率從0.50 mg/g達(dá)到3.20 mg/g,提高了5.4倍。低共熔溶劑稀釋倍數(shù)從10倍增加到40倍時,隨著稀釋倍數(shù)的進(jìn)一步增大,提取率逐漸降低。稀釋到40倍時,提取率為1.30 mg/g,僅為稀釋10倍時提取率的40%。原因可能是低共熔溶劑有一定的極性和黏度,稀釋倍數(shù)增大,適當(dāng)降低黏度,有助于增大黃酮成分的遷移速度。但是,稀釋倍數(shù)過大,極性增大,黃酮化合物的極性差別太大,反而不易于黃酮成分的遷移[10]。綜上所述,在隨后試驗中,選擇稀釋10倍的氯化膽堿/乙二醇低共熔溶劑體系。

        圖4 氯化膽堿/乙二醇體系稀釋倍數(shù)對紅棗總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of dilution ratio of choline chloride/ethylene glycol system on the extraction rate of total flavonoids from red jujube

        2.4 料液比

        稱取紅棗粉1 g置于50 mL具塞三角瓶中,分別加入稀釋10倍及組成摩爾比為1∶2的氯化膽堿/乙二醇10,15,20,25,30 mL,在60 ℃超聲100 W條件下提取30 min。由圖5可知,隨著料液比的增大,紅棗總黃酮的提取率逐漸增大。當(dāng)料液比為1∶20時,提取率為3.21 mg/g,是料液比1∶10時提取率的4.1倍;隨著料液比進(jìn)一步增大到1∶25,提取率幾乎沒有變化(P>0.05)。原因可能為增加溶劑提高了紅棗粉與溶劑之間的濃度差,同時紅棗粉顆粒的擴散空間增加,使紅棗粉與溶劑之間的有效接觸面積增大,有助于更多的黃酮成分?jǐn)U散到溶劑中[11]。當(dāng)料液比達(dá)到1∶20時,擴散達(dá)到平衡,隨著料液比的增大,提取率幾乎沒有增加。

        圖5 料液比對紅棗總黃酮提取率的影響

        2.5 超聲功率

        稱取紅棗粉1 g置于50 mL具塞三角瓶中,加入稀釋30倍及組成摩爾比為1∶2的氯化膽堿/乙二醇20 mL, 60 ℃條件下分別在0,80,100,120,140 W超聲提取30 min。由圖6可知,當(dāng)超聲功率從0 W增加到100 W時,紅棗總黃酮的得率隨著超聲功率的增加逐漸增大。在100 W時,達(dá)到3.21 mg/g,是未超聲處理的3.6倍。當(dāng)超聲功率從100 W增加到140 W時,提取率降低48.3%(P<0.05)。原因可能是隨著超聲功率的增加,超聲破壞細(xì)胞壁的程度增加,有助于黃酮成分從細(xì)胞中遷移到溶劑中。但是,黃酮是具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)的復(fù)雜大分子化合物,高強度的超聲處理可能會破壞黃酮的結(jié)構(gòu),黃酮的提取率反而會降低[12-13]。綜上所述,本試驗選擇100 W作為黃酮的提取條件。

        圖6 超聲功率對紅棗總黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of total flavonoids from red jujube

        2.6 提取時間

        稱取紅棗粉1 g置于50 mL具塞三角瓶中,分別加入稀釋30倍及組成摩爾比為1∶2的氯化膽堿/乙二醇10,15,20,25,30 mL,在60 ℃、超聲100 W條件下提取20,30,40,50,60 min。由圖7可知,總黃酮的提取率隨提取時間的延長逐漸增加。在30 min時,提取率基本接近平衡,達(dá)到3.21 mg/g。隨著提取時間的進(jìn)一步增加,由于大多數(shù)黃酮已經(jīng)溶出,總黃酮的得率沒有顯著變化(P>0.05)。

        圖7 超聲提取時間對紅棗總黃酮提取率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic extraction time on the extraction rate of total flavonoids from red jujube

        2.7 正交試驗

        在單因素試驗的基礎(chǔ)上,采用L9(34)正交試驗對低共熔溶劑協(xié)同超聲波提取紅棗中總黃酮的條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果見表1。

        表1 正交試驗結(jié)果

        由表1中極差R值可知,本試驗中影響紅棗總黃酮提取率各因素的主次順序是低共熔溶劑稀釋倍數(shù)>超聲波功率>料液比>提取時間,表明低共熔溶劑在協(xié)同超聲波提取紅棗總黃酮時具有比較強的作用。直觀試驗表明,處理組A2B3C1D2的紅棗黃酮的提取率最高,為3.27 mg/g;而由k值可知A2B3C2D2為最優(yōu)組合。經(jīng)過驗證試驗,低共熔溶劑協(xié)同超聲波提取紅棗中總黃酮時,在最優(yōu)組合低共熔溶劑稀釋倍數(shù)為10倍、料液比為1∶22、超聲波功率為100 W、提取時間為30 min的條件下,紅棗中總黃酮的提取率為3.32 mg/g。

        3 結(jié)論

        低共熔溶劑協(xié)同超聲波提取紅棗中總黃酮時,采用摩爾比為1∶2的氯化膽堿/乙二醇作為低共熔溶劑體系。在紅棗粉過60目篩、60 ℃的提取條件下,隨著低共熔溶劑稀釋倍數(shù)和超聲波功率的增大,紅棗總黃酮的提取率先升高后降低;隨著料液比的增大和提取時間的延長,紅棗總黃酮的提取率逐漸增大并達(dá)到平衡。低共熔溶劑協(xié)同超聲波提取紅棗中總黃酮的最佳工藝條件為低共熔溶劑稀釋10倍、料液比1∶22、超聲波功率100 W、提取30 min,在此優(yōu)化的條件下,紅棗中總黃酮的提取率為3.32 mg/g。紅棗總黃酮具有豐富的特殊營養(yǎng)功效,有望未來在食品中得到廣泛的應(yīng)用。

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