張杰，徐飛，詹軍，夏金川，趙志峰*，蔣茜，王佐軍

(1.四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610065；2.四川李記樂寶食品有限公司，四川 眉山 620036；3.四川李記醬菜調(diào)味品有限公司，四川 眉山 620030)

泡青菜是四川泡菜中的一種，其風(fēng)味濃郁醇香、酸爽可口，是川菜制作的必備佐料。原料青菜經(jīng)腌制發(fā)酵后產(chǎn)生的香味物質(zhì)可以減輕其原有的辛辣刺激味，產(chǎn)生適宜的辛辣味，并賦予泡青菜獨特風(fēng)味。泡青菜的發(fā)酵過程是香味物質(zhì)種類和數(shù)量不斷演替變化的過程，泡青菜特有風(fēng)味的產(chǎn)生是多種香味物質(zhì)相互作用的結(jié)果?，F(xiàn)已有學(xué)者對泡菜發(fā)酵過程中香味物質(zhì)的組成做了研究，例如：姚英政[1]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對不同腌制時期(原料、發(fā)酵1年、發(fā)酵2年、發(fā)酵3年)的冬菜進行了香味物質(zhì)分析，研究發(fā)現(xiàn)不同時期的發(fā)酵冬菜中共檢測出70種香味物質(zhì)，其中，在不同發(fā)酵時期樣品中均檢測出的香味物質(zhì)成分有3種，分別為苯乙醇、異硫氰酸烯丙酯和苯甲醛。張華芳等[2]對腌制7，14，21，28 d泡菜的香味物質(zhì)進行研究，共檢測出92種，當(dāng)腌制至成熟過程時，酯類、酸類、醇類和腈類物質(zhì)含量均有所增加，而烴類、醛類物質(zhì)含量呈現(xiàn)下降趨勢。四川泡青菜的傳統(tǒng)制作需要經(jīng)歷6個月以上，有時受貨物積壓的原因，發(fā)酵時間甚至超過1年，在此發(fā)酵周期內(nèi)，泡青菜的風(fēng)味變化十分明顯；而現(xiàn)有研究大多脫離了工業(yè)生產(chǎn)實際，取樣間隔過短或過長，不能真實地反映出工業(yè)化泡菜發(fā)酵周期內(nèi)香味物質(zhì)的演變規(guī)律。

本研究以工業(yè)化四川泡青菜為研究對象，采用頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對發(fā)酵18個月內(nèi)的產(chǎn)品進行香味物質(zhì)研究，為四川泡菜的風(fēng)味研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

發(fā)酵時間為0個月(即泡青菜原料)、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、15個月和18個月的泡青菜樣品，編號分別為0M、1M、2M、3M、4M、5M、6M、7M、8M、9M、10M、11M、12M、15M和18M，均取自四川李記醬菜調(diào)味品有限公司。

1.1.2 儀器

BMS-220分析天平 上海卓精電子科技有限公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；GCMS-QP2010 SE氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本Shimadzu公司；DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱 美國Agilent公司；SPME手動進樣裝置(包括SPME手動進樣手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭(24Ga,3pk)) 美國Supelco公司。

B

A

1.2 實驗方法

1.2.1 香味物質(zhì)的提取

參考汪冬冬等[3]的研究方法并加以修改。準(zhǔn)確稱取5.00 g泡青菜樣品，切碎后加入樣品瓶中，蓋好后置于40 ℃恒溫水浴30 min，將已活化好的萃取頭插入瓶中，推出纖維頭，使之與樣品保持1.5 cm的距離，萃取溫度40 ℃，萃取時間15 min。待萃取結(jié)束后抽回纖維頭，拔出萃取頭，再將萃取頭插入GC進樣口，推出纖維頭，于250 ℃條件下解吸5 min，抽回纖維頭后拔出萃取頭，同時啟動儀器并采集實驗數(shù)據(jù)。

1.2.2 香味物質(zhì)的鑒定

色譜條件：HP-5MS彈性毛細(xì)管柱(30 m×0.125 mm×0.125 μm)；載氣：氮氣，不分流進樣；流速為1 mL/min；柱溫程序升溫：初始溫度為40 ℃，保持3 min；從40 ℃升到130 ℃，速率為5 ℃/min，而后在130 ℃保持5 min；從130 ℃升到155 ℃，速率為25 ℃/min，然后從155 ℃升到220 ℃，速率為5 ℃/min，在220 ℃保持5 min，進樣口溫度為240 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源溫度220 ℃；電子能量70 eV，傳輸線溫度220 ℃；接口溫度280 ℃，掃描范圍(m/z)：50～550。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

將所測香味物質(zhì)的質(zhì)譜信息與數(shù)據(jù)庫中已知香味物質(zhì)的質(zhì)譜信息進行比對，根據(jù)相似度的高低進行定性；再根據(jù)被測化合物占所有化合物總色譜峰面積之比，來計算被測組分的相對含量。所得香味物質(zhì)定性、定量結(jié)果采用Origin 9.1軟件進行繪圖，最后采用SPSS 25.0軟件對主體香味物質(zhì)進行聚類分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同發(fā)酵時期泡青菜香味物質(zhì)的對比分析

續(xù) 表

表2 不同發(fā)酵時期泡青菜香味物質(zhì)種類的變化

研究表明，四川泡青菜中的香味物質(zhì)有三大來源：一是泡菜原料，包括蔬菜和香辛料本身的香味物質(zhì)，如蒜中的硫丙醛-S-氧化物[4]、蘿卜中的醇類和萜類[5]、芥菜中的異硫氰酸烯丙酯[6]；二是乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的香味物質(zhì)，如乙酸、丁酸、乳酸、丙酸、琥珀酸、乙烯、丁二醇、乙醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯等[7]；三是其他菌群的發(fā)酵作用產(chǎn)生的香味物質(zhì)，如醋酸菌、酵母菌等[8]。

不同發(fā)酵時期泡青菜的GC-MS圖譜見圖1。香味物質(zhì)的種類和相對含量變化對比見圖2。

圖1 不同發(fā)酵時期泡青菜香味物質(zhì)的總離子流圖

由圖1和圖2可知，通過頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)共檢測出8類共計285種香味物質(zhì)。泡青菜原料主要香味物質(zhì)種類為烴類和酯類，發(fā)酵1～5個月的泡青菜主要香味物質(zhì)種類為醇類和酯類，發(fā)酵6～9個月的泡青菜主要香味物質(zhì)種類為烴類和酯類，發(fā)酵10～11個月的泡青菜主要香味物質(zhì)種類為烴類和醇類，發(fā)酵12～18個月的泡青菜主要香味物質(zhì)種類為烴類和酮類。發(fā)酵18個月期間，烴類、酮類和酯類具有較為明顯的變化趨勢，具體表現(xiàn)為隨著發(fā)酵時間的延長，烴類和酮類物質(zhì)相對含量增加；酯類物質(zhì)分為含硫的氰酸酯類和其他短鏈脂肪酸酯類，氰酸酯類主要來源于原料本身，在泡青菜未成熟時產(chǎn)生辛辣味[9]，相對含量占比最高，在發(fā)酵9個月時由于氰酸酯類被酶和微生物分解，因而辛辣味逐漸減弱，而其他短鏈脂肪酸酯類增加；但是當(dāng)發(fā)酵時間延長至18個月時，無論是氰酸酯類還是其他短鏈脂肪酸酯類相對含量均顯著下降。

2.2 不同發(fā)酵時期泡青菜主體香味物質(zhì)分析

根據(jù)不同發(fā)酵時間泡青菜中各類香味物質(zhì)的含量(見圖3)，采用系統(tǒng)聚類樹法將樣品進行聚類分析，不同發(fā)酵時期主體香味物質(zhì)相對含量的變化情況見表3。

圖3 不同發(fā)酵時期泡青菜聚類分析圖

表3 不同發(fā)酵時期泡青菜主體香味物質(zhì)相對含量變化

由圖3可知，當(dāng)設(shè)定距離為10時，整個發(fā)酵周期內(nèi)的泡青菜可以分為8個發(fā)酵階段，其中0～3個月為第一階段，4個月和5個月分別為第二、三階段，6～7個月為第四階段，8～9個月為第五階段，10～12個月為第六階段，15個月和18個月分別為第七、八階段。根據(jù)聚類分析結(jié)果并結(jié)合表1不同時期香味物質(zhì)種類總相對含量和表3主體香味物質(zhì)相對含量變化情況可知，整個發(fā)酵周期內(nèi)的泡青菜可以分為5個不同階段，即發(fā)酵前期0～5個月，發(fā)酵中前期6～9個月，發(fā)酵中后期10～12個月，發(fā)酵后期15個月，發(fā)酵末期18個月。

表1 不同發(fā)酵時期泡青菜香味物質(zhì)相對含量的變化

發(fā)酵前期0～5個月，泡青菜原料(0個月)中主體香味物質(zhì)有2種，分別為異硫氰酸烯丙酯和異硫氰酸環(huán)丙酯，相對含量分別為9.06%和75.33%；原料中異硫氰酸酯類含量高，隨著發(fā)酵的進行，異硫氰酸酯被酶和微生物分解，使蔬菜原料中的辛辣味逐漸減弱。發(fā)酵1個月時增加了乙醇和乙酸，乙醇和乙酸的產(chǎn)生是由于微生物的作用，是微生物的代謝產(chǎn)物[10]。發(fā)酵第2，3，4，5個月時，主體香味物質(zhì)種數(shù)越來越豐富，主體香味物質(zhì)酯類中的異硫氰酸酯類相對含量不斷下降，這可能是隨著發(fā)酵時間延長，芥子苷酶的活性在此階段急劇下降，異硫氰酸酯類等酶解產(chǎn)物的含量也相應(yīng)地下降；同時，在乳酸菌等微生物的發(fā)酵作用下，整個體系的 pH 值不斷下降，在 pH 降低的情況下，芥子苷在芥子苷酶的作用下主要生成其他化合物。即發(fā)酵前期0～5個月，主要呈現(xiàn)濃郁醇香和辛辣味。

發(fā)酵中前期6～9個月，從主體香味物質(zhì)組成上分析，6個月和7個月的泡青菜共有主體香味物質(zhì)最多，共有組分分別為α-姜黃烯、β-倍半水芹烯、姜烯、1-甲基-4-(1-亞甲基-5-甲基-4-己烯基)環(huán)己烯、(+)-2-Carene、桉葉油醇、異硫氰酸烯丙酯和乙酸芳樟酯，α-姜黃烯、姜烯和β-倍半水芹烯是姜黃精油的主要香味物質(zhì)，屬于萜烯類化合物，普遍易揮發(fā)，閾值低[11]；桉葉油醇有樟腦氣息和清涼的草藥味道[12]；異硫氰酸烯丙酯具有催淚作用，適量地存在可賦予泡青菜特有的芥辣味[13]；乙酸芳樟酯具有類似薰衣草、鈴蘭等的幽雅香氣[14]。除此之外，發(fā)酵6個月的泡青菜還含有乙酸乙酯，具有果香的酒香味[15]；發(fā)酵7個月的泡青菜還含有(E)-β-金合歡烯，主要存在于甜玫瑰油、橙油和桔子油等中。發(fā)酵8個月和9個月的泡青菜共有的主體香味物質(zhì)只有3種，分別為姜烯、丙二醇和乙酸芳樟酯；發(fā)酵8個月的泡青菜特有的主體香味物質(zhì)為β-倍半水芹烯和三醋酸甘油酯；發(fā)酵9個月的泡青菜特有的主體香味物質(zhì)為乙酸和異硫氰酸烯丙酯。發(fā)酵6～9個月時，泡青菜已逐漸趨于成熟，以烴類和酯類物質(zhì)為主要香型貢獻者，呈現(xiàn)濃郁花果香、較淡辛辣味。

發(fā)酵中后期10～12個月的泡青菜共有的主體香味物質(zhì)為α-姜黃烯、(E)-β-金合歡烯、姜烯、1-甲基-4-(1-亞甲基-5-甲基-4-己烯基)環(huán)己烯、(+)-2-Carene、桉葉油醇、Tumerone、乙酸和二硫化碳；發(fā)酵10個月的泡青菜特有的主體香味物質(zhì)為丙二醇、Ar-tumerone和異硫氰酸烯丙酯，發(fā)酵11個月特有的主體香味物質(zhì)為β-倍半水芹烯和異硫氰酸烯丙酯，發(fā)酵12個月特有的主體香味物質(zhì)為β-倍半水芹烯、Ar-tumerone和乙酸乙酯。當(dāng)發(fā)酵10～12個月時，發(fā)酵酸香逐漸增強，此時以烴類、酮類和酸類物質(zhì)為主要香型貢獻者，呈現(xiàn)濃郁花果香和發(fā)酵酸香，以及較淡辛辣味。

發(fā)酵后期15個月泡青菜的主體香味物質(zhì)種類為α-姜黃烯、β-倍半水芹烯、4-蒈烯、姜烯、芳姜黃酮、Tumerone、丁酸和異硫氰酸環(huán)丙酯。發(fā)酵末期18個月泡青菜的主體香味物質(zhì)種類為α-姜黃烯、β-倍半水芹烯、姜烯、Cyclohexene, 4-methyl-3-(1-methylethylidene)-、桉葉油醇、芳姜黃酮、Tumerone、丁酸、異硫氰酸環(huán)丙酯和硫脲。當(dāng)泡青菜發(fā)酵時間延長至15個月和18個月時，不再因為發(fā)酵時間的延長，風(fēng)味向好，泡青菜發(fā)酵15個月香型的貢獻者為烴類和酮類，泡青菜發(fā)酵18個月香型的貢獻者為烴類和其他類。發(fā)酵后期(15個月)和發(fā)酵末期(18個月)的泡青菜均主要呈現(xiàn)濃郁花果香及微微辛辣味和發(fā)酵酸香。

綜上所述，泡青菜發(fā)酵前期(0～5個月)主體香味物質(zhì)主要以醇類和酯類為主，呈現(xiàn)濃郁醇香和辛辣味；發(fā)酵中前期(6～9個月)主體香味物質(zhì)為烴類和酯類，呈現(xiàn)濃郁花果香、較淡辛辣味；發(fā)酵中后期(10～12個月)主體香味物質(zhì)為烴類、酮類和酸類，呈現(xiàn)濃郁花果香和發(fā)酵酸香，以及較淡辛辣味；發(fā)酵后期(15個月)主體香味物質(zhì)為烴類和酮類，發(fā)酵末期(18個月)主體香味物質(zhì)為烴類和其他類，發(fā)酵后期和發(fā)酵末期的泡青菜均主要呈現(xiàn)濃郁花果香及微微辛辣味和發(fā)酵酸香。隨著發(fā)酵時間的延長，烴類、酮類物質(zhì)呈增加趨勢，酯類、醇類物質(zhì)呈下降趨勢。

3 結(jié)論

使用HS-SPME-GC-MS解析了14個不同發(fā)酵時間四川工業(yè)化泡青菜中的香味物質(zhì)變化，最終共檢測出8類，285種香味物質(zhì)，其中有26種為主體香味物質(zhì)，相對含量大于5%。并結(jié)合聚類分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵18個月的泡青菜可以分為5個發(fā)酵階段，即發(fā)酵前期0～5個月、發(fā)酵中前期6～9個月、發(fā)酵中后期10～12個月、發(fā)酵后期15個月、發(fā)酵末期18個月。并且α-姜黃烯、β-倍半水芹烯、(E)-β-金合歡烯、姜烯、乙醇、桉葉油醇、芳姜黃酮、乙酸、異硫氰酸烯丙酯、異硫氰酸環(huán)丙酯、異硫氰酸異丁酯、乙酸乙酯和乙酸芳樟酯，對泡青菜的風(fēng)味形成有重要貢獻。泡菜類發(fā)酵產(chǎn)品一直有“發(fā)酵時間越久，越香”的說法，但根據(jù)本研究結(jié)果來看，當(dāng)處于發(fā)酵后期時，其香味物質(zhì)的種類及含量并非越來越好，本研究的成果或許可以為泡青菜生產(chǎn)企業(yè)改良生產(chǎn)方式、提高企業(yè)效益提供一定借鑒。