易柳彤 楊美林 宮娜娜 余美紅 曹婉維 李展宇 李丹

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，盡管肝癌的診療水平在不斷地提高，但肝癌的新發(fā)病例和死亡病例仍居高不下[1-2]。目前肝切除術(shù)是肝癌根治的最主要手段[3]，然而作為一種高侵襲性腫瘤，肝癌往往呈浸潤性生長(zhǎng)，其衛(wèi)星灶及浸潤邊界往往難以識(shí)別，且肝臟毗鄰腹腔大血管、膽道、胃等重要器官，常規(guī)手術(shù)后并發(fā)癥高達(dá)15%～50%，5年復(fù)發(fā)率達(dá)70%[1,3-4]。因此，術(shù)中肝癌的檢出率和邊界精準(zhǔn)識(shí)別能力的提高，將有利于延長(zhǎng)肝癌患者的生存時(shí)間，提高患者的生存質(zhì)量。

基于熒光成像的手術(shù)導(dǎo)航有助于肝癌的精準(zhǔn)診療。近年來，美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）是一種非靶向近紅外熒光探針，其在正常肝細(xì)胞和癌變肝細(xì)胞間的代謝差異，導(dǎo)致ICG在癌變肝細(xì)胞中的異常累積，從而實(shí)現(xiàn)肝癌病灶的熒光成像，在肝癌的精準(zhǔn)切除中具有重要的臨床意義[5-6]。但有研究表明，瘤周正常肝組織對(duì)ICG的排泄功能受累，形成的背景信號(hào)干擾了腫瘤邊界的精確界定[7]。而特異性靶向的探針，主要是聚集于病灶處，能正確顯示腫瘤的手術(shù)切緣，從而減少正常組織過度切除[8]。目前靶向表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的探針能夠特異靶向聚集于腫瘤組織，并且受背景熒光信號(hào)干擾少，可提高腫瘤組織的成像對(duì)比度，在頭頸鱗癌、胰腺癌和食管癌等腫瘤中有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值[9-10]。因此，靶向熒光探針更加有利于微小腫瘤及腫瘤邊界的術(shù)中精準(zhǔn)可視化，實(shí)現(xiàn)肝癌的完整切除。

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（cellular mesenchymalepithelial transition factor，c-Met） 是 一 種 酪 氨 酸激酶型受體，與配體肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）結(jié)合后被激活，參與惡性腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。經(jīng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，c-Met在胃癌、食管癌和結(jié)直腸癌等惡性消化道腫瘤中異常高表達(dá)，其中在肝癌中高表達(dá)，約65%[12-13]，并且與肝癌的增殖和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移相關(guān)，已經(jīng)成為肝癌診療的重要靶點(diǎn)[14-15]?；诖?，靶向c-Met的近紅外熒光探針在肝癌的精準(zhǔn)診療中將會(huì)有重要的應(yīng)用價(jià)值。

本研究采用一種靶向c-Met并已經(jīng)進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)抗體偶聯(lián)藥物中的單抗SHRmAb[16]和一種具有散射小、背景熒光信號(hào)低和組織穿透能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)的近紅外熒光染料IRDye800CW[10]，成功合成并表征了靶向c-Met探針SHRmAb-IR800[17-18]，通過流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦成像驗(yàn)證了該探針能與肝癌細(xì)胞特異性結(jié)合，并通過動(dòng)物模型的體內(nèi)成像檢測(cè)了該探針能靶向聚集于c-Met陽性的腫瘤組織，基于此來探索該探針的肝癌檢測(cè)能力和評(píng)估其潛在的應(yīng)用價(jià)值。

資料與方法

一、獲取c-Met的表達(dá)信息

從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取c-Met mRNA（MET）在人腫瘤組織中的表達(dá)信息，并比較人肝癌組織和正常肝組織中的MET表達(dá)（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）。然后從HPA數(shù)據(jù)庫中提取人腫瘤組織中c-Met蛋白的表達(dá)信息（http://www.proteinatlas.org）。

二、細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)

人卵巢癌細(xì)胞株（A2780）和人肝癌細(xì)胞株（SK-Hep1和Hep 3B）來自美國模式培養(yǎng)物研究所，而人肝癌細(xì)胞SMMC7721來源于中國上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫。將基礎(chǔ)培養(yǎng)基RPIM-1640配制成含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉菌素的完全培養(yǎng)基，并用完全培養(yǎng)基RPIM-1640培養(yǎng)A2780、SKHep1、Hep 3B和SMMC7721細(xì)胞。所有細(xì)胞均置于含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

三、Western Blot分析

用RIPA裂解液（P0013C，上海碧云天公司）充分裂解細(xì)胞后離心獲得總蛋白，然后用BCA法測(cè)定蛋白的濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，再分別用抗c-Met抗體（8198，美國CST公司）和抗內(nèi)參蛋白GADPH抗體（2118，美國CST公司）于4℃冰箱中孵育過夜，然后用TBST溶液清洗膜3 次后，再加入對(duì)應(yīng)的辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（7074，美國CST公司）室溫孵育1 h，接著用TBST溶液清洗膜3次后，將膜置于ChemiDocXRS +成像儀（美國Bio-Rad 公司）中進(jìn)行顯像。最后重復(fù)試驗(yàn)3次后，用Image J 軟件進(jìn)行灰度分析。

四、流式細(xì)胞術(shù)分析

將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)于10 cm培養(yǎng)皿中，待其生長(zhǎng)約90%時(shí)，用Accutase消化酶（A6964，美國Sigma公司）將細(xì)胞消化至離心管中，然后用PBS清洗離心3次，接著用10 μg/mL抗體（SHRmAb/IgG2或SHRmAb-IR800/IgG2-IR800）于冰面孵育細(xì)胞30 min，再用PBS清洗，然后加入Alexa Fluor 488山羊抗人IgG 抗體（縮寫Alexa 488，1∶200）于室溫孵育細(xì)胞30 min。最后用PBS清洗和1 000 rpm離心4 min，棄上清，重復(fù)3次后，用250 μL PBS重懸細(xì)胞并于流式細(xì)胞儀下檢測(cè)。

五、共聚焦熒光成像實(shí)驗(yàn)

將3～5 ×104腫瘤細(xì)胞接種于共聚焦皿中，培養(yǎng)48 h后用于共聚焦熒光成像。棄培養(yǎng)基后加入PBS清洗，然后再加入10 μg/mL抗體（SHRmAb/IgG2或SHRmAb-IR800/IgG2-IR800）于冰面孵育細(xì)胞30 min。接著再加入4%多聚甲醛固定20 min和0.2% Triton通透5 min。最后加入Alexa 488二抗室溫孵育30 min，棄二抗，再用PBS清洗3次，加入抗熒光淬滅劑（含DAPI） （S2110-5，北京索萊寶公司）染核5 min后，于共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司）下成像。

六、肝癌動(dòng)物模型的構(gòu)建

本研究的相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)通過我院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（00043）。從廣東省動(dòng)物中心購買4～6周齡的雌性BALB/c-nu裸鼠，用于肝癌皮下瘤模型的構(gòu)建。主要是用胰島素注射器將100 μL含3 ×106個(gè)SK-hep1細(xì)胞的混懸液注入小鼠的右肩，共構(gòu)建6只皮下瘤小鼠模型，建模一周后，隔天用游標(biāo)卡尺監(jiān)測(cè)腫瘤的大小，待腫瘤生長(zhǎng)到200 mm3則可進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn)。

七、探針在動(dòng)物模型中的近紅外熒光成像

用異氟烷氣體麻醉裸鼠之后，再給其尾靜脈注 射45 μg抗 體 探 針（SHRmAb-IR800或IgG2-IR800），然 后 于 注 射 后 0.5、6、24、72和 96 h用小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng)（美國PerkinElmer公司）進(jìn)行探針的成像（激發(fā)光：760 nm；發(fā)射光：845 nm）。在96 h時(shí)將小鼠安樂死，并取出小鼠的主要臟器和腫瘤組織進(jìn)行成像。通過成像系統(tǒng)的處理軟件獲取成像的平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）和腫瘤背景比（tumorto-background ratio，TBR），其中TBR是腫瘤處的MFI除以同側(cè)大腿處的MFI。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。所有獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果的連續(xù)變量數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。采用t檢驗(yàn)來比較兩組數(shù)據(jù)的差異。P ＜ 0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、數(shù)據(jù)庫中c-Met的表達(dá)情況

在TCGA數(shù)據(jù)庫中，發(fā)現(xiàn)MET的表達(dá)水平在大多數(shù)腫瘤中都高于正常組織，其中在肝癌組織中顯著高于正常肝組織（P ＜ 0.001） （圖1A、1B）。此外，在HPA數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)c-Met在大多數(shù)腫瘤組織中都高表達(dá)，其中在肝癌中的表達(dá)率為80%（圖1C）。

圖1 數(shù)據(jù)庫中c-Met的表達(dá)分析

二、肝癌細(xì)胞系中c-Met的表達(dá)分析

通過Western Blot分析人肝癌細(xì)胞系的c-Met表達(dá)情況（圖2A、2B），發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞系SK-Hep1、Hep 3B 和SMMC7721都有不同程度的c-Met表達(dá)， 而卵巢癌A2780不表達(dá)c-Met。以上細(xì)胞系可用于后續(xù)探針的特異性結(jié)合能力研究。

圖2 人肝癌細(xì)胞系中c-Met的表達(dá)分析

三、SHRmAb-IR800的體外特異結(jié)合能力檢測(cè)

將抗體探針與腫瘤細(xì)胞共孵育后，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，可見SHRmAb-IR800與各腫瘤細(xì)胞的結(jié)合程度與其c-Met的表達(dá)水平呈正相關(guān)性（圖3A）。另外，將抗體探針和抗體分別與SKHep1肝癌細(xì)胞共孵育，發(fā)現(xiàn)SHRmAb-IR800和SK-Hep1細(xì)胞的結(jié)合，與抗體SHRmAb相比無顯著性差異，但高于對(duì)照組（IgG2-IR800和IgG2）（圖3B）。以上結(jié)果表明，SHRmAb-IR800探針能夠特異結(jié)合c-Met陽性肝癌細(xì)胞。

選擇SK-Hep1進(jìn)行共聚焦成像實(shí)驗(yàn)（圖3C），在0℃ 孵育30 min后可見SHRmAb-IR800濃聚于肝癌細(xì)胞膜上；提高孵育溫度至37℃之后，發(fā)現(xiàn)探針被肝癌細(xì)胞攝取入胞質(zhì)內(nèi)，說明SHRmAb-IR800能夠與c-Met陽性的肝癌細(xì)胞結(jié)合并被攝取。

圖3 SHRmAb-IR800的體外結(jié)合能力分析

四、SHRmAb-IR800在動(dòng)物模型中的活體成像分析

利用SK-Hep1構(gòu)建肝癌皮下模型，14 d后可用于活體成像。如圖4A、4B可見，隨著時(shí)間的推移，SHRmAb-IR800成像的MFI逐漸升高，并且于24 、72和96 h可見，SHRmAb-IR800組的MFI均顯著高于對(duì)照組IgG2-IR800 （P ＜ 0.05）。此外，在96 h時(shí)SHRmAb-IR800的TBR為（2.01 ± 0.18），顯著高于 IgG2-IR800（1.59 ± 0.10，P ＜ 0.05）。

圖4 SHRmAb-IR800在SK-Hep1肝癌皮下模型中的活體成像分析

于肝癌皮下瘤模型活體成像的96 h，收集其皮下瘤組織和主要臟器進(jìn)行近紅外熒光成像（圖5A），以分析SHRmAb-IR800在小鼠體內(nèi)的分布情況。通過成像的定量分析（圖5B），可見SHRmAb-IR800靶向聚集于腫瘤組織，高于正常皮膚和肌肉組織（P ＜ 0.05），并且也高于對(duì)照IgG2-IR800的腫瘤組織（P ＜ 0.05）。另外，將腫瘤組織進(jìn)行免疫組化染色，顯示為c-Met陽性（圖6）。

圖5 SHRmAb-IR800在SK-Hep1肝癌皮下瘤模型中的離體成像分析

圖6 SK-Hep1肝癌皮下瘤的c-Met免疫組化染色分析，比例尺：200 μm & 100 μm

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，該近紅外熒光探針SHRmAb-IR800能夠特異性靶向聚集于c-Met陽性的肝癌組織。

討 論

手術(shù)切除是根治肝癌的最主要方式之一，但由于肝癌浸潤邊界難以在術(shù)中界定，且毗鄰腹腔重要器官，病灶少切一分導(dǎo)致高術(shù)后復(fù)發(fā)率，而多切一分導(dǎo)致嚴(yán)重術(shù)后并發(fā)癥，因此提高術(shù)中肝癌邊界的分辨率是提高患者術(shù)后生存質(zhì)量的關(guān)鍵。目前靶向近紅外熒光成像為術(shù)中腫瘤病灶的精準(zhǔn)識(shí)別和完整切除帶來了重要的契機(jī)[19]。如：2011年，靶向葉酸受體的小分子熒光探針（葉酸-FITC）用于人體卵巢癌手術(shù)切除的臨床研究，其有利于改進(jìn)術(shù)中分期和腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，從而改善患者的預(yù)后[20]；2014年，靶向c-Met多肽與熒光染料Cy5偶聯(lián)的熒光探針GE-137用于人體結(jié)腸息肉癌變鏡檢的臨床研究，其可提高患者的結(jié)腸癌及其癌前病變的檢出率，從而有利于結(jié)腸癌的早診斷和早治療[21]。然而，上述熒光探針的發(fā)射波長(zhǎng)較短，以致其成像易受自體熒光干擾，且信噪比低、組織穿透力差，并且小分子和多肽探針的體內(nèi)半衰期短、靶向能力較弱，因此臨床應(yīng)用受限。為了克服以上探針的局限性，本研究利用基于人源化c-Met抗體和近紅外熒光染料IRDy800CW合成的熒光探針SHRmAb-IR800，以分析其對(duì)于人源肝癌細(xì)胞株和肝癌皮下瘤模型的靶向聚集能力，為肝癌精準(zhǔn)診療探索一種新的輔助手段。

本研究的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均說明，近紅外熒光探針SHRmAb-IR800能特異性識(shí)別c-Met陽性的肝癌腫瘤，有助于肝癌的檢測(cè)，在手術(shù)導(dǎo)航方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。首先，SHRmAb-IR800的發(fā)射光譜在750～850 nm范圍，與染料FITC和Cy5偶聯(lián)的探針相比（520～670 nm），具有較少的自體背景熒光干擾和更高的信噪比[5,22]。另外，SHRmAb-IR800在96 h的成像TBR（2.01 ± 0.18）顯著高于對(duì)照探針組，并且大量研究表明，當(dāng)探針的TBR大于2時(shí)，則具有較高的腫瘤對(duì)比度，提示該探針有助于腫瘤組織和正常組織的辨別[23]。其次，SHRmAb-IR800是利用靶向c-Met的單克隆抗體構(gòu)建的，與多肽探針相比，具有較高親和力（Kd = 1.07 ±0.05）[18]，能特異性聚集于c-Met陽性的肝癌細(xì)胞和組織，并且SHRmAb-IR800在c-Met陽性肝癌中的濃聚程度顯著高于對(duì)照探針（P ＜ 0.05），有利于肝癌的精準(zhǔn)診斷。最后，SHRmAb-IR800具有良好的生物安全性。本研究所用的抗體是已經(jīng)進(jìn)入臨床Ⅰ期試驗(yàn)的抗體結(jié)合藥物中的抗體（SHRmAb），無抗體依賴的細(xì)胞毒性作用和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用，對(duì)機(jī)體組織不產(chǎn)生毒副作用[24-25]；而所用熒光染料（IRDye800CW）的體內(nèi)代謝情況和安全性已被大量研究驗(yàn)證，并且與抗體（西妥昔單抗、帕尼單抗和貝伐單抗等）偶聯(lián)形成的抗體探針也被用于腫瘤的手術(shù)導(dǎo)航臨床試驗(yàn)，具有較好的人體安全性[10]。綜上所述，本課題構(gòu)建的近紅外熒光探針SHRmAb-IR800在肝癌的手術(shù)導(dǎo)航中具有一定的臨床轉(zhuǎn)化潛能。

本研究還存在一些改進(jìn)的地方。首先，于96 h時(shí)，離體成像結(jié)果顯示SHRmAb-IR800在肝臟中有累積，可能會(huì)干擾肝癌原發(fā)病灶的辨別，從而限制其在肝癌手術(shù)導(dǎo)航的應(yīng)用。為了獲得抗體探針的最優(yōu)成像對(duì)比度，可適當(dāng)延長(zhǎng)成像時(shí)間至4～7 d[26-29]，因此本研究可進(jìn)一步延長(zhǎng)SHRmAb-IR800的成像時(shí)間，以獲得最佳的信噪比；另外，還可以進(jìn)一步優(yōu)化該分子探針，以減少正常肝臟攝取，從而提高原發(fā)肝癌的成像對(duì)比度。其次，目前近紅外二區(qū)熒光成像具有更低的光子散射、更高的空間分辨率和更優(yōu)的信噪比，在生物成像領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[30-31]。有研究表明，IRDye800CW染料的發(fā)射光譜也能達(dá)到近紅外Ⅱ區(qū)窗口，因此可利用近紅外Ⅱ區(qū)的成像儀器進(jìn)行研究，從而進(jìn)一步發(fā)掘該探針對(duì)肝癌手術(shù)導(dǎo)航的應(yīng)用價(jià)值。最后，有研究表明c-Met的表達(dá)水平與患者的治療抵抗和預(yù)后差正相關(guān)[32-33]，因此c-Met的靶向分子成像將有利于肝癌的治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估。

綜上，靶向c-Met的近紅熒光抗體探針SHRmAb-IR800能夠特異識(shí)別c-Met陽性肝癌腫瘤，并且在成像96 h具有良好的TBR，這將有利于精準(zhǔn)的肝癌可視化手術(shù)切除，做到“不多切正常肝組織，不少切肝癌組織”，從而提高患者的生存質(zhì)量。