楊 提，曾婷婷，張卉青，葉琳嵐，藺婷婷，丁 楠*

(1.海軍軍醫(yī)大學長海醫(yī)院藥學部，上海 200433；2.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院藥劑科，上海 200135；3.聯(lián)勤保障部隊天津康復療養(yǎng)中心藥械科，天津201112；4.廣東省東莞市濱海灣中心醫(yī)院藥劑科，廣東東莞 523900)

肝纖維化(liver fibrosis)是多種慢性肝病共有的病理特征，主要表現(xiàn)為肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的過度增生和異常沉積[1]。肝纖維化的本質是肝臟對于各種慢性損傷的一種修復反應。多種因素造成的肝損傷如慢性病毒感染(主要是丙型和乙型肝炎)、過量飲酒、代謝紊亂或自身免疫損傷等均可引起肝內結締組織的異常增生，引發(fā)肝纖維化。長期且持續(xù)的肝纖維化會造成器官結構破壞，功能衰退，最終可能導致肝硬化、終末期肝病或肝癌。由于肝纖維化的發(fā)病機制復雜，目前臨床上尚未發(fā)現(xiàn)理想的抗肝纖維化藥物，因此，尋找更為有效和安全的藥物是防治肝纖維化的關鍵問題。

研究表明，傳統(tǒng)中藥復方因具有多靶點、多途徑且毒性低等優(yōu)點，在抗肝纖維化的治療中發(fā)揮著重要作用。其中益氣活血方可通過抑制HSCs活化和促進膠原降解減輕ECM的過度積聚，進而延緩肝纖維化的進程[2]。益氣活血方因成分復雜，其抗肝纖維化的活性成分以及分子機制至今并不十分明確，尚待深入研究。網(wǎng)絡藥理學是基于網(wǎng)絡生物學和多向藥理學，通過構建疾病、基因、靶標和藥物等之間的相互作用網(wǎng)絡，從整體角度出發(fā)，較為全面地解釋中藥組分靶點以及途徑間的相互作用關系的學科[3]。本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法，建立益氣活血方主要成分-靶點網(wǎng)絡圖，預測其發(fā)揮抗肝纖維化作用的主要活性成分、作用靶點及通路，為中醫(yī)藥防治肝纖維化的機制研究提供理論基礎與科學依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 分析軟件和數(shù)據(jù)庫 Cytoscape 3.7.2軟件、R語言軟件(https://www.r-project.org/)；中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，網(wǎng)址http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(Traditional Chinese Medicine Integrated Database，TCMID，網(wǎng)址http://www.megabionet.org/tcmid/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)，String數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/cgi/input.pl)。

1.2 益氣活血方有效化合物的篩選 益氣活血方由黃芪、丹參、云茯苓、白豆蔻、郁金、內金6味中藥組成。通過TCMSP和TCMID分別檢索6味中藥的主要化學成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥ 30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥ 0.18為依據(jù)篩選潛在的藥效成分，并獲取各活性成分的蛋白質靶點。篩選結束后，為標準化蛋白質靶點信息，在UniProt蛋白質數(shù)據(jù)庫將各活性成分的蛋白質靶點名稱進行規(guī)范。

1.3 構建益氣活血方“活性成分-靶點”網(wǎng)絡 主要通過Cytoscape 3.7.2軟件構建與分析益氣活血方“活性成分-靶點”網(wǎng)絡，其中用“節(jié)點”(node)表示成分或靶點，用“邊”(edge)表示兩者之間的關系；采用Cytoscape 3.7.2軟件內置的network analyzer分析工具分析網(wǎng)絡特征參數(shù)，包括連接度、介度及緊密度等，研究益氣活血方中較為重要的活性成分和靶點及兩者之間的關系。

1.4 肝纖維化靶點篩選 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫分別檢索“hepatic fibrosis”、“l(fā)iver fibrosis”獲取肝纖維化相關靶點，以相關性分值(relevance score)≥14為篩選條件，獲得相關性較大的基因作為疾病候選靶點。

1.5 網(wǎng)絡構建 為探究益氣活血方藥物與肝纖維化之間的相互作用關系，利用Venny 2.1.1軟件分析兩者的作用靶點，最終獲得益氣活血方防治肝纖維化的潛在作用靶點，并以韋恩(Venn)圖的形式展現(xiàn)。通過潛在靶點獲得相應的潛在化合物及其所屬中藥名稱，并利用Cytoscape 3.7.2軟件建立中藥-潛在化合物-潛在靶點-疾病網(wǎng)絡圖。

1.6 基因本體功能與通路富集分析 基因本體(gene ontology,GO)是對基因和蛋白質功能進行限定和描述的數(shù)據(jù)庫，包括細胞組分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)三個部分，因不同基因在生物體內協(xié)同發(fā)揮相應的生物學功能，基于京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集通路的分析，更有助于了解基因的生物學功能。應用R語言軟件中clusterProfiler GO.R插件及Perl語言對益氣活血方活性成分與肝纖維化的共同靶點進行GO分析以及KEGG通路富集分析，并對分析結果進行可視化，探究益氣活血方防治肝纖維化可能涉及的生物功能和信號通路。

1.7 觀察指標 觀察指標為益氣活血方主要活性成分，以及活性成分與肝纖維化的共同蛋白質靶點之間的聯(lián)系。

2 結 果

2.1 益氣活血方活性成分及靶點獲取結果 通過TCMSP和TCMID檢索益氣活血方中的6味中藥，并以OB≥30%和DL≥0.18為條件篩選活性成分，經過Uniprot數(shù)據(jù)庫檢索并剔除重復值，得到82種候選活性成分及323個靶點。

2.2 肝纖維化候選靶點篩選結果 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫分別檢索關鍵詞“hepatic fibrosis”、“l(fā)iver fibrosis”，根據(jù)relevance score≥14篩選相關性較大的靶點，合并2個關鍵詞搜索結果后，刪除重復值，共得到肝纖維化相關靶點881個，作為肝纖維化候選靶點。

2.3 潛在活性化合物及靶點篩選結果 采用Venny 2.1.1軟件將益氣活血方候選靶點與肝纖維化候選靶點取交集，得到109個共有靶點(見圖1)，以及對應的潛在72種活性化合物，并根據(jù)潛在靶點與化合物可知所屬中藥名稱，見表1。

表1 益氣活血方治療肝纖維化的相關信息Table 1 Information related to the treatment of liver fibrosis with Yiqi Huoxue decoction

2.4 蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡 將篩選出的109個共有靶點輸入String數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，其他參數(shù)設定為默認值，剔除孤立的靶點蛋白，得到益氣活血方靶點蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡(protein-protein interaction network，PPI)，見圖2。

圖2 益氣活血方抗肝纖維化藥物活性成分-疾病共有靶點蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡Figure 2 Protein-protein interaction network of common targets between active components of Yiqi Huoxue decoction and liver fibrosis

(續(xù)表)

應用R語言count.R插件統(tǒng)計出現(xiàn)頻次在前20位的蛋白質靶點，其中出現(xiàn)頻次較高的有轉錄激活因子-3(signal transducer and activator of transcription-3，STAT3)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶-1(serine/threonine protein kinase-1，AKT1)、原癌基因(proto-oncogene，JUN)、抑癌基因TP53等，可作為益氣活血方抗肝纖維化的潛在靶點。

2.5 網(wǎng)絡構建結果 利用Cytoscape 3.7.2軟件構建中藥-潛在化合物-共有靶點-疾病網(wǎng)絡，得到184 個節(jié)點(110個靶點，72個活性成分，疾病和藥物各1個)，708條邊，見圖3。

圖3 益氣活血方抗肝纖維化藥物活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡圖aFigure 3 Network diagram of active components of Yiqi Huoxue decoction and liver fibrosis targetsaa：粉紅色代表益氣活血方，黃色代表肝纖維化，藍色代表益氣活血方活性成分，綠色代表益氣活血方抗肝纖維化藥物活性成分-疾病共有靶點

網(wǎng)絡拓撲學分析結果顯示，槲皮素(quercetin)連接度為80，介度為0.193 1，緊密度為0.570 1，預測槲皮素為益氣活血方防治糖尿病心肌病的主要成分，其次為木犀草素(luteolin，連接度為39，介度為0.049 8，緊密度為0.458 6)、山奈酚(kaempferol，連接度為35，介度為0.038 9，緊密度為0.447 4)，柚皮素(naringenin，連接度為22，介度為0.026 7，緊密度為0.422 6)，見表2。

表2 益氣活血方主要活性成分網(wǎng)絡節(jié)點特征參數(shù)Table 2 Network node characteristic parameters of main active components of Yiqi Huoxue decoction

2.6 GO功能分析及KEGG富集通路結果 利用R語言對潛在作用靶點進行基因富集分析(根據(jù)Ben-jamin校正法、P<0.05)，進一步探討益氣活血方抗肝纖維化的作用機制。將GO富集分析結果分為BP、CC、MF三類，并根據(jù)信號通路中基因所占總體輸入基因的比率(GeneRatio)排列(展示前15位，見圖4)。氣泡顏色由紅到紫代表P值從小到大，P值越小代表顯著性越強，氣泡越大代表該通路的基因計數(shù)越大，橫軸代表該信號通路基因所占總體輸入基因的比率。圖4A表明益氣活血方抗肝纖維化靶點富集主要涉及的生物學過程為營養(yǎng)元素的應答過程(response to nutrient levels)、脂多糖的應答過程(response to lipopolysaccharide)、氧化應激反應(response to oxidative stress)、類固醇代謝應答過程(response to steroid hormone)、脂多糖的反應(response to lipopolysaccharide)、活性氧代謝過程(reactive oxygen species metabolic process)、小分子代謝過程的調控(regulation of small molecule metabolic process)等。圖4B為細胞組分分析，可見關鍵靶點主要作用于囊泡腔(vesicle lumen)、膜筏(membrane raft)、膜微結構域(membrane microdomain)等。圖4C為分子功能分析結果，可見相關靶點抗肝纖維化的功能主要富集于受體配體活性(receptor ligand activity)、信號受體激活劑活性(signaling receptor activator activity)、細胞因子受

體結合(cytokine receptor binding)、細胞因子活性(cytokine activity)、 DNA結合轉錄因子結合(DNA-binding transcription factor binding)等。KEGG通路富集分析結果根據(jù)GeneRatio排序，展示排名前20位的信號通路，如圖4D所示，益氣活血方抗肝纖維化的作用靶點主要包括PI3K-Akt信號通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、MAPK信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17信號通路等，體現(xiàn)了益氣活血方多成分、多靶點、多通路的作用特點。

3 討 論

肝纖維化是肝臟對損傷的修復反應，是各種慢性肝病共有的病理改變，以ECM在肝臟過度沉積為特征， 屬可逆病變。根據(jù)中醫(yī)經典理論并結合臨床經驗，肝纖維化的主要病機為“氣虛血瘀、肝郁脾虛”，采用“益氣活血、健脾化瘀”方法可改善肝臟儲備功能，延緩或阻止肝纖維化進程。益氣活血方經過多名中醫(yī)藥專家論證，具有滋肝補腎、疏肝健脾之功效，方中黃芪扶正補氣，丹參、郁金活血祛瘀、利膽退黃，云茯苓健脾寧心，白豆蔻開胃消食，臨床上多用于慢性病毒性肝炎肝纖維化的治療。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法初步篩選出益氣活血方抗肝纖維化的活性成分為槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素、丹參酮Ⅱa等。槲皮素、木犀草素、柚皮素均屬天然的黃酮類化合物，具有抗肝纖維化的藥理特性。WU等[4]發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過抑制TGF-β1/Smads信號通路并激活PI3K/Akt信號通路，來抑制經膽管結扎或四氯化碳誘導的肝硬化模型小鼠的肝臟細胞自噬反應，從而減輕肝臟損傷。WANG等[5]發(fā)現(xiàn)槲皮素還能以劑量依賴的方式調節(jié)NF-κB/IкBα、p38 MAPK和Bcl-2/Bax信號的傳導，延緩肝纖維化的進程。CUMMINS等[6]利用人和鼠的肝星狀細胞系研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可通過下調STAT3總量及其磷酸化水平，并抑制其轉錄活性，進而抑制HSCs活化，發(fā)揮抗肝纖維化的作用。LIU等[7]發(fā)現(xiàn)在TGF-β1誘導的HSC-T6細胞中，柚皮素可通過選擇性抑制Smad3的轉錄，從而抑制HSCs增殖和ECM的積聚，減輕肝纖維化程度。山奈酚是一種天然黃酮醇，具有顯著的抗氧化應激活性，可以抑制多種抗氧化酶的表達并減弱脂質過氧化反應，從而發(fā)揮肝細胞保護作用[8]。丹參酮為活血化瘀藥。丹參酮Ⅱa是丹參酮的主要活性成分之一，通過改造其結構，形成磺酸鈉鹽，提高其水溶性，在清除肝臟炎癥、阻滯鈣離子通道，改善肝臟微循環(huán)，逆轉或者抑制肝纖維化方面發(fā)揮著重要作用[9]。以上提示益氣活血方活性成分的篩選具有一定的依據(jù)。

本研究對益氣活血方與肝纖維化的共同靶點進行PPI映射并構建藥物活性成分-肝纖維化-共有靶點網(wǎng)絡圖，對網(wǎng)絡進行拓撲學分析后發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)頻次較高的關鍵靶點有STAT3、TNF-α、AKT1、JUN、TP53等，可作為益氣活血方抗肝纖維化的潛在靶點。STAT3是STAT蛋白家族的成員，作為一種轉錄因子，在肝纖維化進程中占有重要地位[10]。TNF-α為一種致炎因子，可誘導多種纖維化相關因子形成信號網(wǎng)絡，共同調控肝纖維化過程[11]。AKT1作為AKT家族成員之一，參與細胞代謝、調亡、轉錄調控多種生理過程。JUN與抑癌基因TP53在肝纖維化中的關系尚未見報道，今后可加強這方面的研究。以上研究結果提示，益氣活血方可能通過上述幾個關鍵靶點之間的協(xié)同作用共同發(fā)揮抗肝纖維化作用。

GO分析和KEGG通路富集分析明確了益氣活血方在抗肝纖維化作用中的生物學過程以及信號通路。其中涉及的主要生物學過程包括營養(yǎng)元素的應答過程、脂多糖的應答過程、氧化應激反應、類固醇代謝應答過程、脂多糖的反應、活性氧代謝過程、小分子代謝過程的調控等，表明益氣活血方可能通過調控多個復雜的生物學過程發(fā)揮抗肝纖維化作用；涉及的主要信號通路包括PI3K-Akt信號通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、MAPK信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17信號通路等，這些通路與肝炎、肝癌等肝臟相關疾病有密切的關系，在肝纖維化過程中有著重要作用，也表明益氣活血方通過作用于多個信號通路共同發(fā)揮抗肝纖維化作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學技術分析了益氣活血方抗肝纖維化的分子機制，該過程涉及多個不同的生物學過程和信號通路，體現(xiàn)了中醫(yī)藥多成分、多靶點聯(lián)合作用，全方位治療疾病的整體思路。但是本研究僅是以生物信息學和網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫為基礎對益氣活血方抗肝纖維化分子機制的預測，后續(xù)還需要進一步對分析所得的核心成分、關鍵靶點以及信號通路進行實驗驗證，進而闡明益氣活血方發(fā)揮抗肝纖維化作用具體的分子機制。