羅云龍 陳淑怡 王洋 白東清

摘要：本研究選用重要的水產(chǎn)革蘭氏陰性病原菌——嗜水氣單胞菌ATCC35654、CICC10500與副溶血弧菌ATCC17802為指示菌，利用比濁法進(jìn)行試驗(yàn)，以O(shè)D600值為判斷標(biāo)準(zhǔn)，篩選出抑菌能力較強(qiáng)的Pardaxin-4作為抑菌劑，探討其與乳酸共同抑菌作用的量效關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：低濃度的Pardaxin-4可以協(xié)同乳酸抑制嗜水氣單胞菌CICC10500的生長(zhǎng)。當(dāng)Pardaxin-4濃度為30 μmol/L、乳酸濃度為5.5 mmol/L時(shí)對(duì)指示菌能產(chǎn)生相加抑菌作用，12 h致死率達(dá)到88%。研究結(jié)果可為魚(yú)源抗菌肽和乳酸在水產(chǎn)養(yǎng)殖中對(duì)抗革蘭氏陰性病原菌的應(yīng)用以及水產(chǎn)品的保鮮提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：乳酸;抗菌肽;共同抑制;水產(chǎn)養(yǎng)殖

抗菌肽是一類(lèi)由生物細(xì)胞特定基因編碼產(chǎn)生的小分子肽，具有高效的抑菌活性和較高的穩(wěn)定性[1]。然而，革蘭氏陰性菌外膜（OM）作為細(xì)菌的滲透屏障，具有一定的保護(hù)作用，使革蘭氏陰性菌對(duì)抗菌肽存在天然抗性。研究認(rèn)為，外膜通透劑乳酸具有增強(qiáng)革蘭氏陰性菌外膜通透性的作用[2]?；诖耍驹囼?yàn)將乳酸與幾種魚(yú)源抗菌肽聯(lián)合使用，共同處理革蘭氏陰性菌，從而篩選出較為有效的抗菌肽與乳酸組合并評(píng)估其抑菌效果。本研究能夠?yàn)樗a(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中抗菌藥物的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供新思路，也能夠?yàn)楦锾m氏陰性菌疾病的治療與水產(chǎn)品的保鮮提供理論依據(jù)。

1. 材料與方法

1.1指示菌與抗菌肽

嗜水氣單胞菌ATCC35654、CICC10500、副溶血弧菌ATCC17802購(gòu)自中科質(zhì)檢有限公司。魚(yú)源抗菌肽Moronecidin、Misgurin、Pardaxin-4（Pard-4）通過(guò)固相合成法制備，純度大于96%。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1抗菌肽篩選

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的嗜水氣單胞菌ATCC35654、CICC10500、副溶血弧菌ATCC17802菌液接種于LB液體培養(yǎng)基，使活菌數(shù)為1×107 CFU/mL，分別加入不同終濃度（10、50 μmol/L）的抗菌肽。采用96孔板法測(cè)定菌液的OD600值[3]。

1.2.2乳酸與抗菌肽對(duì)革蘭氏陰性水產(chǎn)病原菌生長(zhǎng)的協(xié)同抑制作用

以嗜水氣單胞菌ATCC35654、CICC10500為指示菌，測(cè)定乳酸與抗菌肽對(duì)指示菌的部分最低致死濃度。分別以活菌數(shù)為1×107 CFU/mL的菌液作為對(duì)照組;以乳酸（終濃度為5.5 mmol/L）處理為乳酸處理組;添加不同濃度抗菌肽（終濃度為20、30、40 μmol/L）為抗菌肽處理組;添加不同濃度的乳酸+抗菌肽為共同處理組。每組設(shè)三個(gè)平行。于30 ℃培養(yǎng)12 h后測(cè)OD600值。

各試驗(yàn)組于4 ℃處理0、4、8、12 h后離心（4 ℃，1600 g），棄上清并用無(wú)菌生理鹽水重懸。使用平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，以?xún)A注法倒平板，于30 ℃培養(yǎng)12 h后通過(guò)平板計(jì)數(shù)法計(jì)算菌落數(shù)量[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)分析方法

本研究所有數(shù)據(jù)均用Excel 2003、ORIGIN 8、SPSS 13.0進(jìn)行分析處理。利用Excel軟件計(jì)算得出各組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差;利用ORIGIN 8軟件繪圖;利用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每個(gè)指標(biāo)設(shè)置三個(gè)重復(fù)。

2.2 結(jié)果與分析

2.2.1抗菌肽的初步篩選

選用魚(yú)源抗菌肽Moronecidin、Misgurin、Pardaxin-4作為抑菌劑，考察其對(duì)水產(chǎn)革蘭氏陰性病原菌的抑制作用?？咕臐舛葹?0 μmol/L時(shí)，與對(duì)照組相比，Pardaxin-4單獨(dú)處理組對(duì)指示菌嗜水氣單胞菌ATCC35654、CICC10500、副溶血弧菌ATCC17802的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，生長(zhǎng)抑制率分別為14.4%、9.7%、14.7%;Moronecidin、Misgurin單獨(dú)處理組對(duì)嗜水氣單胞菌ATCC35654 、副溶血弧菌ATCC17802的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，對(duì)嗜水氣單胞菌CICC10500的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。隨著濃度增加（50 μmol/L），以上抗菌肽對(duì)嗜水氣單胞菌ATCC35654、副溶血弧菌ATCC17802的抑制作用降低，對(duì)嗜水氣單胞菌CICC10500的抑制作用升高?？傮w而言，抗菌肽Pardaxin-4對(duì)所有指示菌的生長(zhǎng)均有抑制作用，抑菌能力較強(qiáng)。

2.2.2 抗菌肽的選定與最小抑制濃度的確定

進(jìn)一步篩選乳酸與Pardaxin-4協(xié)同的適宜濃度范圍。對(duì)于嗜水氣單胞菌ATCC35654、副溶血弧菌ATCC17802來(lái)說(shuō)，不同濃度的Pard-4（10、20、30、40 μmol/L）與乳酸（5.5 mmol/L）共同處理對(duì)抑菌效果沒(méi)有明顯提升。各濃度Pard-4與乳酸的共同處理組與乳酸單獨(dú)處理組均降低了指示菌的OD600值，對(duì)指示菌有一定的生長(zhǎng)抑制作用，但是兩組間OD600值沒(méi)有顯著差異，無(wú)法排除共同處理組的抑菌作用完全由乳酸造成的可能。

對(duì)于嗜水氣單胞菌CICC10500，不同濃度Pard-4與乳酸的共同處理組與乳酸單獨(dú)處理組均降低了指示菌的OD600值，對(duì)指示菌有生長(zhǎng)抑制作用。其中，Pard-4與乳酸的共同處理組OD600值顯著低于乳酸單獨(dú)處理組，二者對(duì)嗜水氣單胞菌CICC10500具有協(xié)同抑菌效果。在Pard-4與乳酸的共同處理組中，當(dāng)Pard-4濃度達(dá)到30、40 μmol/L時(shí)，指示菌的OD600值降至最低且不再隨抗菌肽濃度升高而改變。因此，在與5.5 mmol/L乳酸聯(lián)合使用下，對(duì)嗜水氣單胞菌CICC10500有協(xié)同抑菌效果的Pard-4的最小抑菌濃度為30 μmol/L。

2.2.3乳酸與Pard-4對(duì)革蘭氏陰性水產(chǎn)病原菌的協(xié)同致死濃度

以嗜水氣單胞菌CICC10500為指示菌，檢測(cè)細(xì)菌在Pard-4與乳酸協(xié)同處理下的活菌數(shù)。在Pard-4與乳酸協(xié)同處理下，指示菌的活菌數(shù)量隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而減少。乳酸單獨(dú)處理12 h對(duì)嗜水氣單胞菌CICC10500的致死率為72%，Pard-4與乳酸共同處理12 h后嗜水氣單胞菌CICC10500的死亡率為88%。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)Pardaxin-4單獨(dú)處理時(shí)對(duì)三種指示菌均有生長(zhǎng)抑制作用，這可能是源于它對(duì)細(xì)菌膜的成孔活性[5]。試驗(yàn)顯示，Pardaxin-4濃度升高時(shí)對(duì)指示菌嗜水氣單胞菌ATCC35654、副溶血弧菌ATCC17802的生長(zhǎng)抑制作用減弱，此現(xiàn)象的機(jī)理尚未明確;推測(cè)該抗菌肽可能是菌體生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或影響菌體代謝的信息遞質(zhì)，從而促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)。單獨(dú)低濃度乳酸處理對(duì)嗜水氣單胞菌具有一定的生長(zhǎng)抑制作用。當(dāng)以Pardaxin-4與乳酸共同處理嗜水氣單胞菌CICC10500時(shí)，菌體的生長(zhǎng)進(jìn)一步受到抑制，致死率顯著升高。

參考文獻(xiàn)：

[1]唐馨， 毛新芳， 馬彬云， et al. 抗菌肽的研究現(xiàn)狀和挑戰(zhàn) [J]. 中國(guó)生物工程雜志， 2019， v.39;No.329（08）： 92-100.

[2]ALAKOMI H-L， SKYTTA E， SAARELA M， et al. Lactic acid permeabilizes gram-negative bacteria by disrupting the outer membrane [J]. Applied and environmental microbiology， 2000， 66（5）： 2001-5.

[3]馬歡歡， 林洋， 呂欣然， et al. 96孔板法篩選抗黑曲霉性乳酸菌及抑菌機(jī)理研究 [J]. 食品工業(yè)科技， 2017， 38（012）： 171-5.

[4]丁華， 王建清， 王玉峰， et al. 羅勒精油和Nisin復(fù)配抑菌劑抑菌效果的研究 [J]. 中國(guó)調(diào)味品，

[5]LAZAROVICI P， PRIMOR N， LOEW L M. Purification and pore-forming activity of two hydrophobic polypeptides from the secretion of the Red Sea Moses sole （Pardachirus marmoratus） [J]. Journal of Biological Chemistry， 1986， 261（35）： 16704-13.