呂智超，李 旭，武 斌，徐日福，張云影*

1.吉林省經(jīng)濟管理干部學院，吉林長春 130000；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學院，吉林長春 130033；3.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，吉林長春 130118

本實驗以150日齡的海蘭褐蛋雞為試驗材料，采用半定量RT-PCR方法檢測海蘭褐蛋雞不同等級卵泡發(fā)育時期Lats1基因的mRNA表達水平，實驗結(jié)果得出Lats1基因存在于海蘭褐蛋雞卵泡發(fā)育各個時期，并呈現(xiàn)一定表達規(guī)律，說明Lats1基因參與家禽開產(chǎn)時卵泡發(fā)育的調(diào)控，有促進細胞生長的作用。本實驗為進一步研究Hippo信號通路在雞卵泡不同發(fā)育時期控制細胞增殖時空表達模式打下基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

選擇150日齡海藍褐蛋雞40只，在相同的環(huán)境下飼養(yǎng)。在4 ℃低溫條件下，快速分離直徑為1～3.9 mm、4～4.9 mm、5～5.9 mm、6～6.9 mm、7～8 mm和F6-F1的卵泡組織，放于液氮中速凍保存。

1.2 實驗試劑與儀器

微量RNA提取試劑盒(W6221)購自上海華舜公司，TU-1901紫外分光光度計購自北京普析通用儀器有限公司，凝膠成像系統(tǒng)購自上海復日科技有限公司。

1.3 引物的設計與合成

根據(jù)GenBank中的雞Lats1基因mRNA序列（XM_419666.3）和GAPDH基因mRNA序列(K01458)的mRNA為模板，設計半定量實驗的引物如表1。所有引物運用Premier 5.0和Oligo 7.0軟件設計，由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司提供。

表1 引物設計及擴增產(chǎn)物長度

2 實驗方法

2.1 RNA抽提

取新鮮組織100 mg加1 mL TotalRNAExtractor充分研磨，將所得到的RNA溶液一部分用于后續(xù)試驗，一部分置于-70 ℃保存。

2.2 反轉(zhuǎn)錄成cDNA

在0.2 mLPCR管中加4 μL Rnase-free ddH20,1 μL Random Primer p(dN)6（0.2 μg/ μL），70 ℃溫浴5 min，冰浴10 sec。利用離心機離心，然后加入下列試劑：1.0 μL Rnase inhibitor（20 U/ μL），2.0 μL dNTP Mix（10 mmol/L），4.0 μL 5×Reaction Buffer，2.0 μL AMV Reverse Transcriptase（10 U/μL）。37 ℃溫浴5 min，42 ℃溫浴60 min，70 ℃溫浴10 min，-20 ℃保存。

2.3 半定量RT-PCR反應步驟

半定量RT-PCR反應體系（25 μL）：RNasefree Water11 μL，2×Tag MasterMix12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA0.5 μL。半定量PCR反應條件：預變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s（35個循環(huán)），終延伸72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

2.4 半定量RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

Lats1基因與GAPDH基因用2%的瓊脂糖凝膠按1:1的比例，130 V恒壓電泳30 min。然后利用凝膠成像系統(tǒng)對電泳后的凝膠拍照，凝膠圖片會顯示Lats1基因與GAPDH基因的灰度值，通過ImageJ2x、BandScan5.0軟件進行灰度分析，測三次，求平均值。Lats1基因與GAPDH基因灰度值的比值即Lats1基因mRNA的相對表達量。再通過獨立樣本T檢驗和單因素方差（SPSS 18.0軟件）對各組數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

3 半定量RT-PCR實驗結(jié)果與分析

3.1 電泳檢測結(jié)果

用游標卡尺將海藍褐蛋雞的卵巢按直徑大小分為間質(zhì)、等級前卵泡（1～3.9 mm、4～4.9 mm、5～5.9 mm、6～6.9 mm、7～8 mm）和F1～F6等級卵泡。提取150 d海藍褐卵巢的12個組織的總RNA，根據(jù)目的基因片段的大小配置1.5%濃度的瓊脂糖凝膠，將PCR擴增產(chǎn)物與微量溴酚藍混合，1×TAE電泳緩沖液下，在含有溴化乙啶的瓊脂糖凝膠上進行電泳，并通過凝膠電泳成像系統(tǒng)拍照，經(jīng)觀察，能夠清楚的看見28 S、18 S和5 S三條帶，其中28 S的亮度是18 S的兩倍，而5 S是最不亮的。表明提取的總RNA降解少，完整性高。通過核酸蛋白測定儀測定，OD260/OD280值（吸光度值）在1.8～2.2之間，表明此RNA的純度較高。

3.2 Lats1在海藍褐組織中的表達情況

定性PCR檢測了基因Lats1在海藍褐蛋雞肺、卵巢、腎、肝、脾、心、腦和胸腺組織中的表達情況。基因均有表達且表達特異，無引物二聚體和拖尾現(xiàn)象，基因引物特異性強，可用于后續(xù)試驗。

3.3 Lats1基因mRNA在海蘭褐蛋雞不同等級卵泡中的半定量RT-PCR檢測結(jié)果

以GAPDH為內(nèi)標基因，Lats1基因為目的基因。利用半定量RT-PCR檢測基因在150日齡海蘭褐蛋雞卵巢間質(zhì)、1～3.9 mm、4～4.9 mm、5～5.9 mm、6～6.9 mm、7～8 mm、F6、F5、F4、F3、F2和F1共12個卵巢組織中的相對表達量，如表2所示。

從表2看出，在150日齡的海藍褐蛋雞各等級卵泡內(nèi)均檢測有Lats1基因表達，但在不同直徑大小卵泡中的表達豐度有一定的差異。5～5.9 mm卵泡組織中的表達豐度最高，為0.1970；在6～6.9 mm、F5、4～4.9 mm、F3、7～8 mm和間質(zhì)的相對表達量次之；在F6的表達水平最低，為0.1045。5～5.9 mm與1～3.9 mm、F4、F6、F1、F2之間差異顯著（p＜0.05），6～6.9 mm與1～3.9 mm、F6、F4之間差異顯著（p＜0.05），其余的卵泡之間相對表達量差異不顯著（p＞0.05）。Lats1基因mRNA在海藍褐蛋雞各個等級卵泡中，表達量各不相同，在前等級卵泡中的表達量整體高于等級卵泡的表達量，前等級卵泡中表達量呈先上升后下降的趨勢，并在5～6 mm處表達量最高，在等級卵泡中F5表達量最高，F(xiàn)3次之，但整體呈現(xiàn)基本平穩(wěn)的狀態(tài)。

表 2 Lats1基因相對表達量

4 討論

RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是一種常規(guī)的、常見的檢測基因的方法，它具有較高的靈敏度和特異性。定量PCR對實驗儀器和樣本處理的要求都比較高，所以結(jié)果相對半定量而言會更加精準[1]。但是熒光定量PCR相對成本高，對于一些條件設施不完善的工作平臺，選擇一種方法，能夠替代熒光定量PCR，且結(jié)果一致，是有實際利益的。

研究發(fā)現(xiàn)，Hippo信號通路是通過調(diào)節(jié)下游基因的表達，將細胞信號從細胞質(zhì)傳遞到細胞核，從而對細胞的生長、增殖和凋亡進行一個整體調(diào)控，而且，Hippo信號通路還參與器官大小和組織再生的調(diào)控，并在胚胎發(fā)育等過程中發(fā)揮重要作用。本實驗選取的基因Lats1是Hippo信號通路主要基因在家禽的同源基因，為了驗證它們是否是家禽體內(nèi)Hippo信號通路的作用基因，首先我們采用定性PCR方法，驗證選取的基因是否存在家禽組織內(nèi)，再采用半定量RT-PCR方法對基因定量。分析本實驗結(jié)果顯示，Lats1在蛋雞卵巢組織及各個等級卵泡中均有表達，說明Lats1基因參與了卵泡從開產(chǎn)到產(chǎn)蛋高峰的整個過程，前等級卵泡的整體表達水平略高于等級卵泡的表達水平，在前等級卵泡中表達量先升高后降低，在等級卵泡中，表達量基本穩(wěn)定，說明Lats1基因參與家禽開產(chǎn)時卵泡發(fā)育的調(diào)控，也有促進細胞生長的作用。

5 小結(jié)

本文根據(jù)目的基因Lats1和內(nèi)參基因在Genebank上已知序列設計引物，對基因進行體系優(yōu)化及程序優(yōu)化。主要結(jié)果如下：通過定性PCR實驗得出：Lats1在海藍褐蛋雞肺、卵巢、腎、肝、脾、心、腦和胸腺組織中均有表達且表達特異，無引物二聚體和拖尾現(xiàn)象。基因的引物特異性強，可用于后續(xù)試驗。說明Lats1基因存在于家禽中大部分的組織器官。

通過半定量RT-PCR實驗得出：Lats1在海藍褐蛋雞的卵巢間質(zhì)及各個等級卵泡中均有表達，表達量存在一定規(guī)律，前等級卵泡的表達量均大于等級卵泡中的表達量。說明Lats1基因參與家禽開產(chǎn)時卵泡發(fā)育的調(diào)控，有促進細胞生長的作用。