李鈺金，代雨菲，蔡路昀，王 晶，李秀霞

（1 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島 266003 2 浙江大學(xué)寧波研究院 浙江寧波 315100 3 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 杭州 310058 4 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧錦州 121013）

真鯛俗稱“紅加吉”，為近海暖溫性魚類。真鯛魚體側(cè)扁，有紅色、黑色之分。在我國(guó)四大海域及日本、朝鮮及東南亞沿海皆有分布。該魚種口感好，市場(chǎng)價(jià)值高，生長(zhǎng)速度快，抗逆性強(qiáng)，是具商業(yè)價(jià)值的重要魚種之一。真鯛魚肉富含蛋白質(zhì)以及多種維生素、鈣、磷、鐵及尼克酸等營(yíng)養(yǎng)成分，其味道鮮美，肉質(zhì)嫩滑，營(yíng)養(yǎng)豐富[1-3]。在魚類貯藏和加工過程中，其食味特性、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值都會(huì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)發(fā)生變化，同時(shí)也伴隨著汁液流失、脂肪氧化和組織結(jié)構(gòu)破壞等現(xiàn)象，均會(huì)造成腐敗變質(zhì)的發(fā)生。作為魚肉的主要功能成分之一，蛋白質(zhì)在內(nèi)源酶和微生物聯(lián)合作用下發(fā)生降解、變性等是導(dǎo)致魚肉品質(zhì)下降的主要原因。蛋白質(zhì)可以分為肌原纖維蛋白、肌漿蛋白和肌基質(zhì)蛋白3 類[4]。蛋白質(zhì)的完整性與魚體肌肉組織的各種功能特性密切相關(guān)，其中肌原纖維蛋白含量最高，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)直接影響肌肉品質(zhì)。解凍過程與凍結(jié)過程是相逆的，影響著冷凍肉品品質(zhì)和食用價(jià)值，同時(shí)在解凍處理過程中也會(huì)影響肌肉組織的理化特性。在解凍過程中，魚體中冰晶融化導(dǎo)致汁液損失，微生物恢復(fù)活性，加速脂肪和蛋白氧化[5]。近年來，研發(fā)提高冷凍食品品質(zhì)和產(chǎn)品效益的新型解凍方式一直是食品科學(xué)領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，解凍方式在肌原纖維蛋白方面已經(jīng)引起研究者們的廣泛關(guān)注，本文探究4 種解凍方式對(duì)真鯛品質(zhì)特性、蛋白構(gòu)象及氧化、水分狀態(tài)變化和組織結(jié)構(gòu)的影響以及變化趨勢(shì)，通過取用真鯛背部肌肉測(cè)定其汁液流失率、質(zhì)構(gòu)、熱穩(wěn)定性、微觀結(jié)構(gòu)及水分分布等指標(biāo)，并提取真鯛背部肌肉肌原纖維蛋白，測(cè)定其粒徑、紫外吸收光譜、內(nèi)源熒光光譜、流變特性等指標(biāo)，從而評(píng)價(jià)不同解凍方式對(duì)真鯛理化性質(zhì)和蛋白質(zhì)功能特性的影響，為尋找更適合的解凍方式提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

真鯛，采購(gòu)于錦州當(dāng)?shù)氐乃a(chǎn)市場(chǎng)；殼聚糖磁性納米，購(gòu)于西安瑞禧生物科技有限公司；其余試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AF-10 制冰機(jī)，斯科茨曼制冰機(jī)系統(tǒng)有限公司；970CRT 熒光分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；PQ001 低場(chǎng)核磁共振分析儀，上海紐邁電子科技有限公司；LabRAM HR Evolution 拉曼光譜儀，HORIBA 公司；Biofuge stratos 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo 公司；DHR-1 流變儀，美國(guó)TA 公司；Free Zone2.5 真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco 公司；UV-2550 型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；S-4800 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；Milli-Q 超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore 公司；DSC-Q2000 差示掃描量熱儀，美國(guó)TA 公司；CX-1 層析柜，上海嘉鵬科技有限公司；NN-DF382M 微波爐，上海松下微波爐有限公司；RC-4HA 溫度記錄儀，江蘇精創(chuàng)電氣股份有限公司。

1.3 樣品處理

將新鮮真鯛（平均體重800 g±50 g）去頭、皮和內(nèi)臟等副產(chǎn)物后，取其背部肌肉總質(zhì)量約為（150±30）g，用去離子水清洗干凈后均分為5 份魚塊（8 cm×3.5 cm×3 cm）并用保鮮膜包裹，每片質(zhì)量約30 g。一份作為新鮮樣品，其余魚塊放在-20 ℃冰箱冷凍24 h 為解凍試驗(yàn)做準(zhǔn)備。4 個(gè)處理組分別為：微波解凍（MT）；遠(yuǎn)紅外解凍（FT）；CS@Fe3O4微波解凍（CMT）；CS@Fe3O4遠(yuǎn)紅外解凍（CFT）。對(duì)照組為新鮮樣品（FS）。

1.4 解凍方法

1.4.1 微波解凍（MT） 本試驗(yàn)采用的微波參數(shù)為功率300 W，2 450 MHz，將魚塊放在微波爐中進(jìn)行解凍。用溫度記錄儀進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)樣品中心溫度達(dá)到0 ℃時(shí)為解凍終點(diǎn)。

1.4.2 遠(yuǎn)紅外解凍 （FT） 將兩個(gè)紅外管 （4～14 μm，12 mm×300 mm，300 W） 安裝在層析柜的兩側(cè)，層析柜溫度設(shè)定為10 ℃，將魚塊放進(jìn)層析柜中。解凍過程和解凍終點(diǎn)同1.4.1 節(jié)。

1.4.3 CS@Fe3O4微波解凍 （CMT） 配制質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的CS@Fe3O4溶液，將包裹保鮮膜的冷凍魚塊放入溶液中，確保魚塊完全浸沒后放入微波爐中解凍。解凍終點(diǎn)同1.4.1 節(jié)。

1.4.4 CS@Fe3O4遠(yuǎn)紅外解凍 （CFT） 將包裹保鮮膜的冷凍魚塊放入配制好的CS@Fe3O4溶液中，完全浸沒溶液后放入裝有紅外管的層析柜中解凍。解凍終點(diǎn)同1.4.1 節(jié)。

1.5 肌原纖維蛋白的提取

肌原纖維蛋白的提取根據(jù)文獻(xiàn)[6]的方法，并稍作修改，將4 組解凍后魚肉用絞肉機(jī)攪碎成肉糜，每個(gè)處理組稱取10 g 放于離心管中，加入4倍體積的磷酸鹽緩沖溶液 （20 mmol/L Na2HPO4，pH=7.2）提取液，用均質(zhì)機(jī)以4 000 r/min，均質(zhì)30 s，共3 次，之后經(jīng)5 000 g、4 ℃離心15 min，去除上清液，沉淀再加入4 倍上述磷酸鹽緩沖溶液重復(fù)步驟（均質(zhì)、離心）3 次。最后取沉淀用4 倍體積的漂洗液（20 mmol/L，0.6 mol/L NaCl，pH=6.7）均質(zhì)、離心（同上述條件），上清液即為肌原纖維蛋白溶液，存放在4 ℃冰箱中，24 h 內(nèi)使用。

1.6 理化特性的測(cè)定

1.6.1 汁液流失率 將魚塊在-20 ℃下凍結(jié)24 h后稱重（M1），通過不同的解凍方式后，當(dāng)魚塊中心溫度到達(dá)0 ℃時(shí)解凍終止，將保鮮膜中的汁液倒掉，再用吸水紙將樣品擦干后稱重（M2）。解凍汁液流失率按照下式計(jì)算[7]：

式中：F——解凍汁液流失率，%；M1——解凍前樣品質(zhì)量，g；M2——解凍后樣品質(zhì)量，g。

1.6.2 質(zhì)構(gòu) 參考汪蘭等[8]方法稍作修改，將解凍后的樣品切成2 cm×2 cm×2 cm 的方塊，測(cè)量時(shí)將樣品放置在探頭底座中心點(diǎn)，使用TA.XT Plus 物性分析儀進(jìn)行質(zhì)構(gòu)測(cè)定。探頭型號(hào)為P/50 探頭，參數(shù)設(shè)定：測(cè)前速度為2.0 mm/s，測(cè)試速度為3.0 mm/s，測(cè)后速度為3.0 mm/s，壓縮程度30%，壓縮時(shí)間間隔5 s，壓縮次數(shù)2 次。每組樣品做8 個(gè)平行，測(cè)定指標(biāo)包括彈性、咀嚼度和硬度。

1.7 動(dòng)態(tài)流變的測(cè)定

動(dòng)態(tài)流變的測(cè)定參考崔旭海等[9]的方法稍作修改。用絞肉機(jī)將魚肉絞碎取適量均勻涂于流變儀的測(cè)試平臺(tái)上，為防止水分揮發(fā)用石蠟密封。測(cè)試參數(shù)為：采用溫度掃描模式，平衡樣品2 min，振蕩頻率為1 Hz，應(yīng)變0.1%，平行板間距為1 mm，升溫掃描范圍為20～90 ℃，升溫速率為2.0 ℃/min，研究魚肉的儲(chǔ)能模量（彈性模量）G′和損耗模量（黏性模量）G"隨溫度變化的規(guī)律，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行。

1.8 熱穩(wěn)定性的測(cè)定

參考Cai 等[10]方法稍作修改，采用差示掃描量熱儀進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確稱取5～7 mg 待測(cè)樣品于氧化鋁坩堝中，加蓋用壓片機(jī)密封后，以空坩堝作對(duì)照，使用DSC 儀器進(jìn)行測(cè)定。參數(shù)設(shè)定：在20 ℃恒溫保持1 min，升溫速度為2 ℃/min，從20 ℃加熱至90 ℃結(jié)束測(cè)定。

1.9 肌原纖維蛋白構(gòu)象與聚集程度的測(cè)定

1.9.1 拉曼光譜分析 將樣品涂抹在載玻片中央由拉曼光譜儀測(cè)定，調(diào)節(jié)好焦距后直接進(jìn)行測(cè)定，參數(shù)設(shè)定[11]：激光波長(zhǎng)532 nm，功率120 mW，曝光時(shí)間60 s，拉曼位移波數(shù)范圍為400～3 600 cm-1，每個(gè)樣品取3 個(gè)點(diǎn)進(jìn)行掃描。

1.9.2 紫外光譜分析 將樣品的肌原纖維蛋白用磷酸鹽緩沖溶液（20 mmol/L，0.6 mol/L NaCl，pH=6.7） 稀釋至2 mg/mL，空白對(duì)照為磷酸鹽緩沖溶液。常溫下采用紫外分光光度計(jì)，檢測(cè)波長(zhǎng)區(qū)間范圍為200～400 nm，波長(zhǎng)間隔1 nm，掃描紫外吸收光譜。

1.9.3 內(nèi)源熒光光譜掃描分析 參考Cao 等[12]的方法并稍作修改，將樣品的肌原纖維蛋白用磷酸鹽緩沖溶液（20 mmol/L，0.6 mol/L NaCl，pH=6.7）稀釋至0.5 mg/mL。利用熒光分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行光譜掃描，參數(shù)設(shè)定：激發(fā)波長(zhǎng)295 nm，發(fā)射光譜范圍為310～500 nm，靈敏度為3，掃描速度為高速，激發(fā)狹縫為10 nm，發(fā)射狹縫為10 nm，每組樣品掃描3 次。

1.9.4 粒徑分析 使用90 Plus 納米粒度分析儀測(cè)定蛋白質(zhì)的粒徑分布，將樣品的肌原纖維蛋白用磷酸鹽緩沖溶液 （20 mmol/L，0.6 mol/L NaCl，pH=6.7）稀釋至3 mg/mL。置于比色皿中放入測(cè)量池，測(cè)定溫度25 ℃，平衡時(shí)間1 min，散射角90°，波長(zhǎng)659 nm。每組處理測(cè)定重復(fù)3 次。

1.10 水分分布狀態(tài)的測(cè)定

水分分布狀態(tài)分析條件及參數(shù)設(shè)定參照Li等[13]稍作修改。將解凍后的樣品切成10 mm×10 mm×15 mm 的立方體并擦干表面水分放入核磁管中，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脈沖序列采集樣品T2弛豫時(shí)間的信號(hào)。具體參數(shù)設(shè)定如下：測(cè)試溫度為32 ℃，共振頻率SFI=22 MHz，90°脈沖時(shí)間P90=14 μs，180°脈沖時(shí)間P180=28，主頻SW=100 kHz，D3=80，重復(fù)時(shí)間TR=3 500 ms，模擬增益RG1=30，模擬增益RG2=3，累加次數(shù)NS=4，回波間τ=150 μs，回波個(gè)數(shù)Echocnt=8 000。每組樣品做3 個(gè)平行。結(jié)果由MultiExp Inv Analysis 軟件進(jìn)行反演處理。

1.11 SEM 的測(cè)定

微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定參照王嵬等[14]的方法并略作修改。將魚肉樣品切成薄片（3 mm×3 mm×2 mm），并用體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液固定24 h，除去固定液，再用磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.2）漂洗15 min，漂洗3 次，接著用去離子水同樣漂洗3 次，然后依次采用50%，70%，80%，90%的乙醇溶液梯度洗脫15 min，最后用100%乙醇脫水3次，每次15 min。接著在真空冷凍干燥機(jī)中干燥24 h。每組樣品做3 個(gè)平行。真空冷凍干燥后將樣品黏在樣品臺(tái)上，用離子濺射鍍膜儀進(jìn)行離子濺射鍍金，然后利用掃描電鏡進(jìn)行掃描觀察，樣品放大5 000 倍拍照，電壓3 kV。

1.12 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 軟件進(jìn)行相關(guān)性數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)是3 次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，使用Excel 2010、Origin 9.1 軟件作圖。結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)的分析

2.1.1 汁液流失率分析 經(jīng)過冷凍后魚體水分生成的冰晶會(huì)破壞肌原細(xì)胞，造成機(jī)械損傷。同時(shí)經(jīng)過解凍過程會(huì)加速蛋白質(zhì)的變性和降解，造成汁液流失。汁液流失率是衡量肌肉持水力的常用指標(biāo)之一。汁液流失不僅會(huì)導(dǎo)致水溶性蛋白和肌漿蛋白的流失，還會(huì)影響肉質(zhì)的嫩度和組織狀態(tài)[15]。一般情況下，汁液流失率越低，肌肉品質(zhì)越好。不同解凍方式真鯛的汁液流失率如圖1所示。由圖1可知，4 種不同的解凍方式中，F(xiàn)T 和CFT 汁液流失率最高（1.80%和1.67%），這可能是因?yàn)榻鈨鰷囟容^高及解凍時(shí)間較長(zhǎng)破壞組織結(jié)構(gòu)，加速水溶性物質(zhì)的流失，導(dǎo)致持水性下降。CMT 汁液流失率最低（1.40%），且顯著（P＜0.05）低于其它3 組，更有效緩解了魚體汁液的流失。

圖1 不同解凍方式對(duì)真鯛汁液流失率的影響Fig.1 Effect of different thawing methods on thawing loss rate in red sea bream

2.1.2 質(zhì)構(gòu)分析 不同解凍方式對(duì)質(zhì)構(gòu)特性影響從表1可知，整體而言，測(cè)定的指標(biāo)變化趨勢(shì)稍有不同。FT 和MT 的硬度值均顯著高于其它樣品（P＜0.05）?？赡苁怯捎贑S@Fe3O4溶液的均勻作用使樣品軟化，部分FT 和MT 樣品由于加熱不均勻沒有融化，并且肌肉肌原纖維密度增大。由此可得出CFT 和CMT 能有效且均勻地保持真鯛的硬度。貯藏24 h 后，整體硬度都呈下降趨勢(shì)，且都顯著低于新鮮樣品（P＜0.05）。咀嚼度是摸擬咀嚼和吞咽狀態(tài)所需的能量，與硬度指標(biāo)相同。與新鮮樣品相比各解凍組咀嚼度及硬度均呈下降趨勢(shì)，F(xiàn)T 和MT 樣品的咀嚼度高于CFT 和CMT，CFT 和CMT顯著低于新鮮樣品（P＜0.05）。這種變化主要原因可能是由于隨著溫度升高，肌肉組織中內(nèi)源酶活性增強(qiáng)，導(dǎo)致肌原纖維蛋白水解嚴(yán)重。同時(shí)解凍后24 h 所有處理組的硬度和咀嚼度無明顯差異，且顯著低于新鮮樣品（P＜0.05）。彈性表示施加外力后，恢復(fù)其形變的程度。4 組方式對(duì)應(yīng)的彈性無顯著差異（P＞0.05），其中MT 樣品的彈性值最低，新鮮樣品的彈性值明顯高于其它4 組，CFT 和CMT的彈性值下降較緩慢與新鮮樣品接近。貯藏24 h后，F(xiàn)T 樣品的彈性值下降幅度最大且顯著低于新鮮樣品（P＜0.05）。黏聚性是模擬表示樣品內(nèi)部的一種黏合力也是一種內(nèi)聚力。與新鮮樣品相比，各處理組的黏聚性均有所下降，其中MT 和CMT 的黏聚性高于FT 和CFT 組，而FT 黏聚性顯著低于其它處理組（P＜0.05）。這可能由于肌肉因溫度增高受損而使細(xì)胞間結(jié)合力不斷下降，組織變得疏松。從黏聚性和回復(fù)性來看，所有處理組變化較緩慢，其中FT 黏聚性顯著低于新鮮樣品（P＜0.05），MT 組回復(fù)性顯著低于新鮮樣品（P＜0.05）。綜合來看，F(xiàn)T 組解凍效果最差，CMT 解凍效果最好，持水性較好，肌原纖維間結(jié)合緊密，具有較高的鮮度。

表1 不同解凍方式對(duì)真鯛質(zhì)構(gòu)的影響Table 1 Effect of different thawing methods on texture in red sea bream

2.2 動(dòng)態(tài)流變分析

不同解凍方式處理的真鯛動(dòng)態(tài)學(xué)流變特性見圖2，儲(chǔ)能模量（G′）表示結(jié)構(gòu)中由彈性變形量變化而引起的能量變化，損耗模量（G"）表示加熱過程中黏性的變化，反映肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的折疊和聚集。其中，圖2a 表示儲(chǔ)能模量（G′）隨溫度變化的曲線圖；圖2b 表示損耗模量（G"）隨溫度變化的曲線圖。由圖所示，所有處理組G′和G"曲線變化趨勢(shì)一致，損耗模量從20 ℃開始下降，直至45～55 ℃左右結(jié)束下降。接著損耗模量繼續(xù)升高直至約65～75 ℃結(jié)束升高，然后迅速下降直至90 ℃。G′在45 ℃左右達(dá)到了最低值且開始上升，是因?yàn)槌^了變性溫度，蛋白發(fā)生了沉淀和聚集再次形成空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在45～55 ℃左右G′增加主要是由于肌球蛋白部分展開，蛋白質(zhì)間發(fā)生相互作用，是凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的初始階段。在70 ℃的變化是由于肌球蛋白和肌漿蛋白變性所致。溫度在70～80 ℃時(shí)，肌動(dòng)蛋白開始發(fā)生變性。說明肌動(dòng)蛋白在凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成中起著至關(guān)重要的作用[16-17]。溫度在上升到90 ℃時(shí)，F(xiàn)S 樣品的G′是所有樣品中最高的，其次是CMT，而MT 和FT 在解凍后樣品中彈性較低。與新鮮樣品相比解凍處理后的樣品均有一定程度的蛋白質(zhì)破壞。貯藏24 h 之后的4 組樣品G′均下降，其中CMT 保持其彈性特征最好。而G"隨溫度的變化趨勢(shì)與G′基本一致，F(xiàn)S 樣品高于其它樣品，其次是CMT、CFT、MT 和FT，貯藏后的樣品均表現(xiàn)出較差的黏彈性，CMT表現(xiàn)出與FS 相似的相對(duì)理想黏性性能。在整個(gè)溫度變化中G' 始終高于G"，說明彈性成分高于黏性成分。經(jīng)過CMT 處理后的肌原纖維蛋白能夠形成相對(duì)較理想、較穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖2 不同解凍方式對(duì)真鯛彈性模量G′（a）和黏性模量G″（b）的影響Fig.2 Effect of different thawing treatments on the G′and G″ of red sea bream

2.3 DSC 分析

利用DSC 測(cè)定不同解凍方式對(duì)真鯛在加熱過程中的熱變性中點(diǎn)溫度以及變性所需的焓變值（表2）。圖3是肌原纖維蛋白加熱過程中的DSC掃描曲線，從圖可以看出在肌原纖維蛋白加熱過程中有3 個(gè)吸收峰，分別代表的是肌球蛋白頭部、肌球蛋白尾部和肌漿蛋白、肌動(dòng)蛋白引起的熱流變化。蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性是由吸熱峰的相變溫度和焓變值體現(xiàn)的，而焓變值（ΔH）是由峰面積積分得到的，表示蛋白質(zhì)變性所需要吸收的熱量。熱力學(xué)轉(zhuǎn)變溫度越高，焓變值越高，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性越高越不容易變性[18-19]。由表所示，所有樣品的峰1 和峰3 值的焓變值大于峰2 的焓變值，說明肌球蛋白頭部和肌動(dòng)蛋白變性程度要大于肌球蛋白尾部和肌漿蛋白。CFT 和CMT 組的Tm和ΔH 均高于FT 和MT 處理組，其中CMT 組顯著高于其它3 種處理組（P＜0.05）。解凍后貯藏24 h 后，4 組處理的Tm和ΔH 值都呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，其中在肌球蛋白頭部、肌球蛋白尾部和肌漿蛋白的Tm值均顯著低于新鮮樣品（P＜0.05），在肌球蛋白尾部和肌漿蛋白、肌動(dòng)蛋白的ΔH 值顯著低于新鮮樣品（P＜0.05）。MT 和FT 樣品的蛋白質(zhì)變性可能是由于樣品溫度過高、解凍時(shí)間長(zhǎng)、蛋白質(zhì)氧化或蛋白質(zhì)與水的結(jié)合較弱等原因造成的。局部過熱達(dá)到變性點(diǎn)或劇烈振蕩使氫鍵松動(dòng)可能導(dǎo)致部分肌球蛋白移位不穩(wěn)定。結(jié)果表明，CFT 和CMT 處理后其肌原纖維蛋白溶液結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。

圖3 不同解凍方式對(duì)真鯛DSC 掃描曲線的變化Fig.3 Effect of different thawing treatments on the DSC scanning curve of red sea bream

表2 不同解凍方式對(duì)真鯛熱變性中點(diǎn)溫度和熱焓值的變化Table 2 Tmax and △H values obtained by different thawing treatments for red sea bream

2.4 肌原纖維蛋白構(gòu)象與聚集程度的分析

2.4.1 拉曼光譜分析 酰胺I 帶（1 670～1 700 cm－1）主要源于肽鍵C＝O 伸縮振動(dòng)、C-N 伸縮振動(dòng)及N-H 的面內(nèi)彎曲振動(dòng)，通常用來評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的主鏈構(gòu)象以及對(duì)各蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析。利用二階求導(dǎo)和去卷積對(duì)酰胺Ⅰ帶進(jìn)行分峰處理，再結(jié)合曲線擬合的方法，得到單個(gè)峰位信息，對(duì)比不同二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)峰的峰面積，計(jì)算出不同樣品蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量。酰胺I 帶拉曼光譜峰的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由1 650～1 660 cm-1（α-螺旋）、1 660～1 665 cm-1（無規(guī)則卷曲）、1 665～1 680 cm-1（β-折疊）和1 680 cm-1附近（β-轉(zhuǎn)角）等構(gòu)成[20-21]，其中α-螺旋代表的是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的有序性，無規(guī)則卷曲代表蛋白質(zhì)的無序和松散結(jié)構(gòu)。圖5是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)百分比圖，各處理組表現(xiàn)出不同的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的含量。FS 的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的含量分別是35.69%，37.58%，3.07%和23.66%。MT，CMT，F(xiàn)T 和CFT 組α-螺旋含量相對(duì)于新鮮樣品分別降低1.83%，1.21%，2.01%和1.22%，無規(guī)則卷曲相對(duì)增加了0.98%，0.68%，0.58%和0.72%。同時(shí)，貯藏24 h 之后的4 組樣品α-螺旋含量相對(duì)于新鮮樣品分別降低3.78%，3.65%，3.9%和4.64%，無規(guī)則卷曲相對(duì)增加了1.58%，2.68%，4.64%和2.12%。α-螺旋都有較大程度的減少，無規(guī)則卷曲也有較大程度的增加。因此可以得出CFT 和CMT 的α-螺旋降低較少，無規(guī)則卷曲增加較少，有利于蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，不同程度的提高蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，且與蛋白熱穩(wěn)定性的結(jié)果相一致。

圖4 不同解凍處理對(duì)真鯛拉曼光譜的變化Fig.4 Effect of different thawing treatments on the Raman spectra of red sea bream

圖5 酰胺Ⅰ區(qū)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量（%）Fig.5 Secondary structure content of myofibrillar protein from amide Ⅰregion

2.4.2 內(nèi)源熒光光譜掃描分析 內(nèi)源熒光光譜掃描可以反映出蛋白質(zhì)三級(jí)構(gòu)象的變化。通常在波長(zhǎng)為295 nm 的條件下，以色氨酸殘基被激發(fā)后其氧化程度及其微環(huán)境的變化來表征蛋白質(zhì)三級(jí)構(gòu)象的變化[22]。樣品的肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光光譜圖如圖6所示。由圖中的表格可看出，與新鮮樣品相比，解凍后4 組的魚肉肌原纖維蛋白的最大熒光峰位發(fā)生了紅移現(xiàn)象（向長(zhǎng)波方向移動(dòng)），這表明色氨酸殘基的微環(huán)境轉(zhuǎn)移，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，但樣品間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≥0.05），說明解凍處理對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響與FS 相比均不顯著。4 組解凍處理組之間的熒光強(qiáng)度無顯著性差異（P≥0.05），且與鮮樣相比也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≥0.05），且CFT 和CMT 的熒光強(qiáng)度與新鮮樣品較相近。在貯藏24 h 后，4 組都顯示非常低的熒光強(qiáng)度且顯著低于新鮮樣品（P＜0.05），這意味著蛋白分子展開使活性基團(tuán)暴露致使分子間作用力增強(qiáng)，色氨酸殘基出現(xiàn)熒光猝滅現(xiàn)象熒光強(qiáng)度下降。結(jié)果表明，CFT 和CMT 組與FT 和MT 組相比能降低真鯛肉蛋白質(zhì)的變性程度。

圖6 不同解凍方式對(duì)真鯛肌原纖維蛋白內(nèi)源熒光光譜圖Fig.6 Intrinsic fluorescence spectra of myofibrillar protein from red sea bream by different thawing methods

2.4.3 紫外光譜分析 紫外吸收二階導(dǎo)圖譜可以用來反映氨基酸殘基微環(huán)境的變化和蛋白質(zhì)三級(jí)構(gòu)象的變化。一般來說，環(huán)境極性增大吸收峰向短波長(zhǎng)方向移動(dòng)，稱為藍(lán)移，環(huán)境極性減少吸收峰向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，稱為紅移[23]。通過計(jì)算兩個(gè)峰頂與峰谷距離的比值r=a/b 來判斷酪氨酸殘基所處的微環(huán)境變化進(jìn)而反映蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[24]。由圖7所知，光譜上有兩個(gè)正吸收峰（287 nm 和296 nm） 和兩個(gè)負(fù)吸收峰 （282 nm 和293 nm）。與FS 相比，處理組在296 nm 處的峰有明顯的紅移，說明經(jīng)過冷凍和解凍之后蛋白分子展開，蛋白變性開始，此結(jié)果與內(nèi)源熒光光譜相一致。從圖中的表格可以看出，CFT 和CMT 的r 值與FS無顯著性差異更為接近，MT 和FT 的r 值小于FS，說明蛋白質(zhì)中可能存在一定的聚集。在貯藏24 h 后，4 組處理組r 值均顯著低于FS，說明蛋白質(zhì)氧化程度高，聚集程度大。由內(nèi)源熒光光譜和紫外吸收光譜均表明，MT 和FT 處理對(duì)色氨酸和酪氨酸的微環(huán)境影響較大，CFT 和CMT 處理組可減緩蛋白質(zhì)氧化，蛋白三級(jí)構(gòu)象較穩(wěn)定。

圖7 不同解凍方式對(duì)真鯛肌原纖維蛋白紫外光譜圖Fig.7 UV second derivative spectra of myofibrillar protein from red sea bream by different thawing methods

2.4.4 粒徑分析 蛋白質(zhì)的粒徑能夠直觀的表現(xiàn)出蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和聚集程度，影響著蛋白質(zhì)的功能特性。也可以通過粒徑峰值來評(píng)價(jià)粒徑強(qiáng)度分布。粒徑峰值越高，分布越小，粒徑越均勻[25]。由圖8a 所示，F(xiàn)S、CST 和CFT 的粒徑分布峰值均高于其它樣品，且均較其它樣品更薄，且有效粒徑值均較小，其中FS 和CFT 有效粒徑顯著低于其它處理組（P＜0.05），說明CFT 和CMT 處理可抑制蛋白聚集，穩(wěn)定性較好。由圖8b 結(jié)果表明，經(jīng)過貯藏24 h 后的樣品，CST 和CFT 的粒徑分布峰值保持較高但4 組的有效粒徑值呈增加的趨勢(shì)，且顯著高于鮮樣（P＜0.05），出現(xiàn)了嚴(yán)重聚集現(xiàn)象，降低了系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

圖8 不同解凍方式對(duì)真鯛肌原纖維蛋白粒徑變化Fig.8 Particle diameter of myofibrillar protein in red sea bream treated by different thawing methods

2.5 水分分布狀態(tài)分析

通過低場(chǎng)核磁共振技術(shù)分析真鯛肌肉中水分的分布和遷移情況。弛豫時(shí)間（T2）間接用來表征水分的自由度，T2時(shí)間越短表明水分H 質(zhì)子自由度越小，其受到的束縛越大，反之，水分H 質(zhì)子受到的束縛越小，表明水分越自由，對(duì)應(yīng)的T2弛豫時(shí)間就越長(zhǎng)。相同弛豫時(shí)間里對(duì)應(yīng)的弛豫峰面積可以表示對(duì)應(yīng)水量的多少[26]。在T2圖譜上，可以看出T2在0～1 000 ms 內(nèi)出現(xiàn)4 個(gè)特征峰，分別表示強(qiáng)結(jié)合水（T2b），弱結(jié)合水（T21），不易流動(dòng)水（T22）和自由水 （T23），對(duì)應(yīng)的4 個(gè)峰的峰面積分別記為P2b，P21，P22和P23。

本試驗(yàn)就不易流動(dòng)水和自由水的峰比例進(jìn)行分析，由表3可知，MT、CMT、FT 和CFT 的P22和P23分別為89.11%，89.75%，87.80%，88.38%和5.69%，5.27%，7.10%，7.08%。可以明顯看出，經(jīng)過冷凍和解凍后，與新鮮樣品相比解凍后樣品的不易流動(dòng)水的峰面積占比逐漸降低，自由流動(dòng)水的峰面積占比逐漸升高。其中FT 最低且顯著低于其它3 組，MT、CFT 和CMT 與鮮樣最為接近。這是因?yàn)樵诮鈨鲞^程中，通過冰晶的作用導(dǎo)致水與蛋白質(zhì)分子之間的作用力降低，不易流動(dòng)水向自由水轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致汁液流失率增高，持水性低。同理，貯藏24 h 后，P22降低且P23升高，CMT 樣品中不易流動(dòng)水占比降低緩慢，說明不易流動(dòng)水含量相對(duì)較高，持水性較好。

表3 不同解凍處理對(duì)真鯛弛豫時(shí)間和峰比例的影響Table 3 Effect of different thawing treatments on the T2 transverse relaxation time and peak scales of red sea bream

圖9 不同解凍方式對(duì)真鯛水分遷移的影響Fig.9 Effect of different thawing treatments on moisture migration in red sea bream

2.6 SEM 分析

不同解凍方法對(duì)真鯛微觀結(jié)構(gòu)的影響如圖10所示。新鮮的真鯛樣品肌纖維排列整齊且間隙緊密、一致，肌內(nèi)膜和肌束膜結(jié)構(gòu)完整。經(jīng)冷凍解凍后，肌肉組織在電鏡下呈現(xiàn)不同程度的劣變，F(xiàn)T和MT 組的肌原纖維在電鏡下呈現(xiàn)出明顯的收縮，直挺的肌纖維結(jié)構(gòu)出現(xiàn)溝渠和松散，肌肉組織肌纖維排列發(fā)生明顯分層。CFT 和CMT 解凍后，魚肉組織肌束間隙稍有增大，肌纖維有斷裂現(xiàn)象，但其結(jié)構(gòu)排列與對(duì)照組最為接近。在冷藏24 h后，各組肌肉的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了更大程度的劣變，出現(xiàn)脫節(jié)和纖維斷裂現(xiàn)象，肌肉的肌節(jié)可能會(huì)發(fā)生聚合或收縮，加速了間隙的增大[27-28]。肌纖維結(jié)構(gòu)出現(xiàn)更明顯的斷裂和分層，說明蛋白質(zhì)發(fā)生氧化和變性現(xiàn)象同時(shí)導(dǎo)致汁液流失嚴(yán)重，肌肉組織的完整性遭到嚴(yán)重破壞，使肌肉失去完整的微觀結(jié)構(gòu)。

圖10 不同解凍方式對(duì)真鯛微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.10 Effect of different thawing treatments on the microstructure of red sea bream

3 結(jié)論

本文主要研究了4 種不同解凍方式對(duì)真鯛處理后，其肌肉理化性質(zhì)、肌原纖維蛋白氧化程度和構(gòu)象以及水分分布的影響。得出如下結(jié)論：首先，在肌肉理化特性的分析中，CMT 處理的汁液流失率最低，持水性較好，并且能有效保持魚肉硬度、彈性以及黏聚性。其次，在蛋白質(zhì)構(gòu)象分析中，通過動(dòng)態(tài)流變得出CMT 表現(xiàn)出與FS 相似的相對(duì)理想黏性性能，能夠形成相對(duì)較理想、穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。DSC 分析中得出CFT 和CMT 處理后其肌原纖維蛋白溶液結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，拉曼光譜結(jié)果顯示CFT和CMT 的ɑ-螺旋降低較少，無規(guī)則卷曲增加較少，不同程度的提高蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。內(nèi)源熒光光譜和紫外吸收光譜結(jié)果相一致，CFT 和CMT處理組與FT 和MT 處理組相比可減緩蛋白質(zhì)氧化，蛋白三級(jí)構(gòu)象較穩(wěn)定。同時(shí)利用粒徑對(duì)蛋白聚集和氧化程度進(jìn)行分析，CFT 組有效粒徑較小，系統(tǒng)穩(wěn)定性較強(qiáng)。最后，在微觀結(jié)構(gòu)及水分分布遷移分析后得出，CFT 和CMT 與新鮮樣品最為接近，結(jié)構(gòu)較為緊密有序，肌纖維斷裂現(xiàn)象不明顯。CMT組遭受冰晶的破壞程度較低，持水性較強(qiáng)。