肖小年，盛丹梅，周 潔，易孜成，朱碧泉，張 俊，易 醒*

（1 南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院 南昌 330047 2 南昌大學(xué)中德食品工程中心 南昌 330047）

大蒜油（Garlic oil，GO）是從大蒜鱗莖中提取出的一種揮發(fā)油，微溶于水，易溶于有機溶劑和大多數(shù)非揮發(fā)性油，且容易被氧，光，熱，水分和其它腐蝕性物質(zhì)降解[1]。GO 化學(xué)成分復(fù)雜，主要活性成分為有機硫化物、氨基酸類、酶類、苷類、糖類和微量元素等[2]，其活性功能有抗菌消炎[3-4]、抗氧化[5-6]、降血脂、降血壓[7-8]、抑制癌癥和腫瘤[9-12]及提高免疫力[13]等。

自微乳是由油相、表面活性劑、助表面活性劑組成的一種混合體系，在溫和攪拌下遇水可自乳化成粒徑小于100 nm 的水包油型乳劑。將GO 制備成自微乳，可改善大蒜油的溶解性能，延緩活性物質(zhì)水解，提高穩(wěn)定性和生物利用度。

目前關(guān)于大蒜揮發(fā)油[14]、大蒜素[15]和大蒜有機硫化物[16]等抑菌研究的報道較多，而對大蒜油自微乳 （Garlic oil self-microemulsion，GO-SMEDDS）抑菌機理的研究鮮有報道，對GO 自微乳化后的抑菌作用了解不多。本研究以GO-SMEDDS 為對象，研究GO-SMEDDS 對6 種食品常見腐敗菌的抑制效果，同時以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為研究對象，通過分析和測定抑菌圈、微觀結(jié)構(gòu)、菌液電導(dǎo)率、堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase，AKP）含量變化、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT） 和谷草轉(zhuǎn)氨酶 （aspartic transaminase，AST）的酶活變化等，探討GO-SMEDDS 對試驗菌株的作用機制，為GO 的進一步開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料 大腸桿菌（ATCC29922）、金黃色葡萄球菌 （ATCC6538）；枯草芽孢桿菌（CMCC63501）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）、白色念珠菌（CMCC98001）、釀酒酵母（ATCC9763）、腦心浸液培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱生物科技有限公司；0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）、2.5%戊二醛固定液、溶菌酶，福州飛凈生物有限公司；六甲基二硅氨烷、乙酸異戊酯，西隴試劑；堿性磷酸酶（AKP）測試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.1.2 主要設(shè)備與儀器 SW-CJ-1F 潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；GR85DA 高壓蒸汽滅菌鍋，SANYO 公司；LRH-100SDP 藥物穩(wěn)定性試驗箱，上海印溪儀器儀表有限公司；TGL-12C高速離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司；SHZ-82A 恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DNM-9602 全波長酶標(biāo)儀，Thermo Scientific公司；DDS-307 電導(dǎo)率儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司；JSM-6701F 冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社。

1.2 試驗方法

1.2.1 GO-SMEDDS 制備 采用本試驗室先前方法[17]制備GO-SMEDDS。

1.2.2 菌種的活化和菌懸液的制備 根據(jù)說明書將凍干菌種活化，放入恒溫培養(yǎng)搖床（細菌培養(yǎng)溫度為37 ℃，真菌培養(yǎng)溫度為27 ℃；以下培養(yǎng)條件相同）120 r/min 培養(yǎng)至對數(shù)生長期 （細菌培養(yǎng)10 h，真菌培養(yǎng)16 h）。將培養(yǎng)好的菌懸液稀釋10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6后，將稀釋好的菌懸液分別取100 μL 涂布在相應(yīng)的平板上，培養(yǎng)24 h 后計算菌落平均數(shù)，并計算每毫升中菌落形成單位（Colony-forming unit，CFU）：CFU=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。菌落數(shù)調(diào)至106～107CFU/mL 制成菌懸液，置4 ℃條件儲存，備用。

1.2.3 抑菌圈的測定 用打孔器制作直徑6 mm濾紙片，并將其滅菌備用。用二倍稀釋法將GO 和GO-SMEDDS 稀釋成質(zhì)量濃度為15，7.5，3.75 mg/mL 的溶液，將已滅菌的濾紙片分別放入上述3 種質(zhì)量濃度的溶液中浸泡8～10 h。取100 μL 106CFU/mL 的菌懸液于瓊脂培養(yǎng)基均勻涂布，取3 片不同質(zhì)量濃度的濾紙片貼于培養(yǎng)基中，倒放培養(yǎng)。培養(yǎng)24～48 h 后，分別取出培養(yǎng)皿，打開培養(yǎng)皿的蓋子，用鑷子取出濾紙片，再蓋上玻璃蓋觀察抑菌圈出現(xiàn)情況及直徑大小，并用游標(biāo)卡尺測量直徑并記錄。試驗重復(fù)3 次，計算平均值。

1.2.4 最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定 采用兩倍稀釋法測定GD-SMEDDS 對菌株的最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）。將9 支無菌試管進行編號并加入5 mL 液體培養(yǎng)基，1 號試管中加入5 mL 稀釋后的GO-SMEDDS或GO，采用二倍稀釋法稀釋1～7 號試管的樣品濃度，使無菌試管中GO-SMEDDS 的最終質(zhì)量濃度為25，12.5，6.25，3.125，1.563，0.781，0.391 mg/mL，GO 的最終質(zhì)量濃度為3.75，1.875，0.938，0.469，0.234，0.117，0.059 mg/mL，再分別加入5 mL 菌懸液；8 號試管以5 mL 菌懸液和5 mL 液體培養(yǎng)基作為生長對照組，9 號試管以5 mL 菌懸液和5 mL 蒸餾水作為空白對照組?；靹蚝蠛銣負u床培養(yǎng)觀察各試管中菌種的生長情況，無菌生長的試管中的樣品質(zhì)量濃度為樣品對該菌種的最低抑菌濃度。試驗重復(fù)3 次。

取無菌生長試管中的液體100 μL 涂平板，倒置培養(yǎng)后，觀察無肉眼可見的菌落生長的最高稀釋度 （最低質(zhì)量濃度） 為最低殺菌質(zhì)量濃度（Minimum bactericidal concentration，MBC）。

1.2.5 細胞形態(tài)的SEM 檢測 將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌加入液體培養(yǎng)基中，恒溫搖床培養(yǎng)24 h 后各取10 mL，加入GO-SMEDDS，使菌懸液中液體GO-SMEDDS 的終濃度為1 MIC，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別于4，12，24 h 取菌懸液離心（3 000 r/min，10 min），棄去上清液。沉淀用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液漂洗3 次，2.5%戊二醛溶液4 ℃固定4 h，棄去戊二醛后經(jīng)一系列乙醇（體積分數(shù)為50%，70%，90%，100%） 逐級脫水，各濃度各浸泡8 min，100%酒精浸泡15 min，每一步后都離心（3 000 r/min，5 min）。乙酸異戊酯浸泡過夜后涂到金屬箔片上，滴入六甲基二硅氨烷，樣品干燥后鍍金，上SEM 觀察。

1.2.6 細胞壁通透性的測定 將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌加入液體培養(yǎng)基中，恒溫搖床培養(yǎng)24 h 后配置成106CFU/mL 的菌懸液（各3 組），加入GO-SMEDDS，使菌懸液中GO-SMEDDS 質(zhì)量濃度分別為0 mg/mL，1 MIC，2 MIC，繼續(xù)培養(yǎng)8 h，分別于0，1，2，4，6，8 h 取菌懸液離心 （3 500 r/min，10 min），按照AKP 試盒法處理上清液并計算酶活。

1.2.7 菌液電導(dǎo)率的測定 將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌加入液體培養(yǎng)基中，恒溫搖床培養(yǎng)24 h后配置成106CFU/mL 的菌懸液 （各3 組），加入GO-SMEDDS，使菌懸液中GO-SMEDDS 質(zhì)量濃度分別為0 mg/mL，0.5 MIC，1 MIC，繼續(xù)培養(yǎng)8 h，于0，1，2，4，6，8 h 取菌懸液離心（3 500 r/min，10 min），用電導(dǎo)率儀測定上清液的電導(dǎo)率。

1.2.8 ALT 和AST 的測定 將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌加入液體培養(yǎng)基中，恒溫搖床培養(yǎng)24 h 后配置成106CFU/mL 的菌懸液（各3 組），加入GO-SMEDDS，使菌懸液中GO-SMEDDS 質(zhì)量濃度為1 MIC，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，于6，12，18，24，48 h取菌懸液離心 （3 500 r/min，10 min），分別按照ALT 和AST 試劑盒法處理上清液并計算酶活。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗3 次平行處理，用Excel 軟件進行平均值分析，用Origin8.5 軟件繪制曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈

由表1可知，GO 和GO-SMEDDS 對6 種常見菌均有抑制作用，且抑菌效果隨著其質(zhì)量濃度增加而增強。整體上，兩種樣品的抑菌效果大小為：真菌（白色念珠菌和釀酒酵母）＞革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌）＞革蘭氏陰性菌（銅綠假單胞菌和大腸桿菌）。GO 及其自微乳體系對真菌的抑制作用強于細菌，可能是由于GO 的親脂性可以穿透細胞膜和細胞器膜導(dǎo)致線粒體等細胞器損傷，最終導(dǎo)致真菌死亡[18]，或者GO 中活性成分破壞了細胞生長的能量來源及磷脂雙分子結(jié)構(gòu)，從而破壞了細胞的完整性，最終顯示抑菌效果[19]。

表1 不同濃度GO 和GO-SMEDDS 的抑菌圈Table 1 Bacteriostatic cycles of GO and GO-SMEDDS at different concentrations

兩種樣品對革蘭氏陽性菌的抑制作用都強于革蘭氏陰性菌，這可能與兩者細胞壁結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。革蘭氏陽性菌的細胞壁是由一層厚而致密的肽聚糖和包括磷酸壁的酸性多糖組成，而革蘭氏陰性菌的細胞壁是由肽聚糖，脂蛋白，磷脂和脂多糖構(gòu)成，形成交聯(lián)度低，結(jié)構(gòu)松散的多層結(jié)構(gòu)。細胞壁的結(jié)構(gòu)不同，會導(dǎo)致兩種細菌對樣品液的敏感性不同[20]。

2.2 GO-SMEDDS 的最小抑菌濃度和最低殺菌濃度

采用比濁法測定了GO 和GO-SMEDDS 對6種菌種的MIC 和MBC，結(jié)果見表2。GO 對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和釀酒酵母的MIC 分別為0.938，0.469，0.234，0.234，0.117，0.117 mg/mL，GO-SMEDDS 對上述6 種菌株的MIC 分別為1.875，0.938，0.469，0.469，0.234，0.234 mg/mL，兩種樣品液均對真菌有較強的抑制效果，對大腸桿菌抑制效果最差，這與抑菌圈試驗結(jié)果相一致，進一步說明細胞壁的差異會影響抑菌效果。由表2可知GOSMEDDS 的MIC 和MBC 均高于GO 的MIC 和MBC，表明GO-SMEDDS 的抑菌效果低于GO，可能是由于微乳液包埋體系對GO 的抗菌效果產(chǎn)生了負面影響[21]，因為表面活性劑會對系統(tǒng)的抗菌性產(chǎn)生影響，且表面活性劑質(zhì)量濃度越高，抗菌性越弱[22]。

表2 大蒜油及其自微乳體系對細菌和真菌的MIC 和MBCTable 2 MIC and MBC of garlic oil and its microemulsion system to bacteria and fungi

2.3 GO-SMEDDS 的抑菌機理

2.3.1 SEM 分析 經(jīng)GO-SMEDDS 處理后大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的形態(tài)見圖1和圖2。

由圖1可知，對照組大腸桿菌呈桿狀，表面平滑，兩端圓潤，無芽孢。經(jīng)MIC 濃度的GOSMEDDS 處理4，12，24 h 后，大腸桿菌表面開始皺縮，產(chǎn)生褶皺，扭曲變形，處理24 h 的菌體已發(fā)生明顯萎縮并融為一體；由圖2可知，對照組金黃色葡萄球菌表面光滑，菌體飽滿，經(jīng)GO-SMEDDS 處理后，菌體表面產(chǎn)生凹陷和不規(guī)則的凸起。且兩株菌種隨著GO-SMEDDS 處理時間的延長，菌體變形現(xiàn)象逐步加重。

圖1 透射電子顯微鏡下大腸桿菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)（×10 000）Fig.1 Morphological structure of E.coli under transmission electron microscope（×10 000）

圖2 透射電子顯微鏡下金黃色葡萄球菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)（×20 000）Fig.2 Morphological structure of Staphylococcus aureus under transmission electron microscope（×20 000）

試驗結(jié)果說明：GO 能使細胞生物膜受到破壞，使細胞發(fā)生嚴重的質(zhì)壁分離，最終導(dǎo)致細胞死亡，這與王一非等[23]研究結(jié)果相似；且自微乳體系能減緩大蒜油的釋放，因此GO-SMEDDS 能在較長時間里保持抑菌效果。

2.3.2 GO-SMEDDS 對細菌細胞壁通透性影響堿性磷酸酶（AKP）是位于細胞壁和細胞膜之間的一種重要的酶，正常情況下很難在菌體細胞外檢測到AKP 酶存在，當(dāng)細胞壁被破壞后，AKP 酶會泄露到細胞外，使得胞外能檢測到AKP 酶[24]。由圖3可知，在GO-SMEDDS 作用后的菌液里可以檢測到AKP 酶，且隨著作用時間的延長酶活不斷升高；在2 h 后空白對照組的AKP 酶活趨于穩(wěn)定，而處理組樣品AKP 酶活顯著高于空白對照組，反映了GO-SMEDDS 可使菌體的細胞壁完整性遭到破壞，可導(dǎo)致AKP 泄露。這與陳夢玲等[25]研究發(fā)現(xiàn)細菌細胞壁被破壞后，菌液AKP 活力顯著提升相一致。

圖3 AKP 酶活Fig.3 The activity of AKP

2.3.3 GO-SMEDDS 對菌液電導(dǎo)率的影響 細胞膜在菌體正常生長過程中起重要作用，當(dāng)菌體細胞膜被破壞時，菌體內(nèi)部K+，Na+等金屬離子和細胞電解質(zhì)會滲出到培養(yǎng)液中，使電導(dǎo)率變大，故可通過電導(dǎo)率的改變反映出菌體細胞膜通透性的變化[26-27]。由表3可知，經(jīng)GO-SMEDDS 處理的菌液的電導(dǎo)率均高于空白對照組，且處理時間越長，菌液電導(dǎo)率越高，大蒜油的質(zhì)量濃度與電導(dǎo)率呈正相關(guān)，表明GO-SMEDDS 能破壞細菌的細胞膜，大蒜油對細菌的作用呈劑量依賴性，這與李橋妹等[28]的研究結(jié)果相似。

表3 GO-SMEDDS 對兩種菌液電導(dǎo)率（μs/cm）影響Table 3 Influence of GO-SMEDDS on the conductivity （μs/cm） of the two strains

2.3.4 GO-SMEDDS 對菌液中ALT 酶和AST 酶的影響 轉(zhuǎn)氨酶是一種胞內(nèi)酶，在氨基酸合成中起核心作用，能夠間接影響蛋白質(zhì)的合成，轉(zhuǎn)氨酶中常被用來作為細菌細胞被破壞的指標(biāo)酶為ALT和AST，因此，檢測上清液中ALT 和AST 的活力即可判斷細胞膜被破壞的程度[29]。

試驗中分別檢測對照組和GO-SMEDDS 組的ALT 和AST 活力，并用圖4的ALT 和AST 標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出轉(zhuǎn)氨酶的活力，結(jié)果見圖5、圖6。試驗表明，經(jīng)GO-SMEDDS 作用后的菌液中的ALT 和AST 活力均有升高，并在24 h 時達到最大值，但隨著時間的延長，菌液中兩者活力均呈現(xiàn)下降趨勢，可能是菌液中細菌達到衰亡期，菌體代謝減弱，代謝酶含量也隨之減少[30]。大腸桿菌菌液中酶活高于金黃色葡萄球菌，說明GO-SMEDDS 能夠破壞細菌的細胞膜，擾亂細菌胞內(nèi)酶的體系，抑制細菌生長，其中對大腸桿菌的影響效果更為明顯。

圖5 ALT 酶活Fig.5 The activity of ALT

圖6 AST 酶活Fig.6 The activity of AST

3 結(jié)論

本文考察了GO-SMEDDS 對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和釀酒酵母的體外抑菌活性和抑菌機制。由抑菌圈直徑可知，GO-SMEDDS 對白色念珠菌的抑制作用最強，抑菌圈直徑可達15.5 mm；對大腸桿菌的抑制作用最弱，抑菌圈直徑為10.3 mm；且抑菌作用隨著大蒜油質(zhì)量濃度的增加而增加。根據(jù)最低抑菌質(zhì)量濃度和最低殺菌質(zhì)量濃度結(jié)果可知，GO-SMEDDS 對真菌的抑制作用最強，其次是革蘭氏陽性菌，最后是革蘭氏陰性菌。GOSMEDDS 的抑菌機制是通過影響和破壞菌體細胞壁結(jié)構(gòu)，引起細胞形態(tài)變形，AKP 酶泄露，以及通過再減弱細胞膜選擇透過性，引起菌體內(nèi)ALT，AST 等胞內(nèi)物質(zhì)外泄和電導(dǎo)率升高，影響細胞多肽和蛋白質(zhì)代謝等的正常降解與合成，從而最終導(dǎo)致菌體死亡，發(fā)揮抑菌效果。

研究中考察了GO-SMEDDS 對6 種常見菌種的體外抑菌活性，初探了對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌機理，后續(xù)可關(guān)注GO-SMEDDS 對菌體蛋白質(zhì)的合成量，呼吸代謝，遺傳物質(zhì)DNA或RNA 的合成等方面的影響，獲得GO-SMEDDS抑菌更全面的認識。本研究可為GO-SMEDDS 在食品行業(yè)的廣泛應(yīng)用提供理論參考。