陳 茉 白書寧 王 行 呂 浩 董 娜

(東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030)

腸道是營養(yǎng)物質消化吸收的主要器官，與動物機體物質代謝和生長發(fā)育密切相關[1]。大腸桿菌廣泛地分布于自然界內(nèi)，是人和動物腸道中的常居菌，一般情況下不會引起動物疾病，甚至在一定程度上有利于維持動物腸道微生態(tài)的平衡。但在某些情況下，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli, ETEC)會表現(xiàn)出致病性，可導致動物機體感染和中毒，引發(fā)各類腸道疾病[2]，ETEC有很多血清型，其中K88是導致畜禽腹瀉的重要病原菌。當畜禽感染K88后，病菌會在腸道內(nèi)大量繁殖，引發(fā)動物腹瀉甚至死亡[3-4]，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[5]。

飼糧與動物腸道健康息息相關，通過開發(fā)功能性飼料添加劑以增強動物抗病抗菌能力，改善動物腸道及機體健康已成為研究熱點[6]。天然植物多糖是一種新型、綠色、高效的飼料添加劑，受到了人們廣泛關注。其中，南瓜多糖(pumpkin polysaccharide，PP)是一種大量存在于南瓜中的植物多糖[7]，價格相對低廉，且具有抗氧化、提高免疫、降血糖等生物學功能，對動物腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用[8-10]。

本試驗通過灌胃ETEC K88感染小鼠建立腸道炎癥模型，研究PP對小鼠血清生化指標、血清及肝臟抗氧化指標以及腸道和肝臟炎癥因子表達的影響，探究PP對動物腸道的保護作用及其機制，可以為ETEC感染導致的腸道炎癥提供新的治療思路，并為PP作為飼料添加劑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PP由陜西某生物有限公司提供(純度為80%)；ETEC來自東北農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，使用前濃度調(diào)整為5.0×109CFU/mL；血清及肝臟中的總抗氧化能力(T-AOC)和氧化氫酶(CAT)活性采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行檢測，T-AOC測定試劑盒產(chǎn)品號為A015-1-2，CAT活性測定試劑盒產(chǎn)品號為A007-1-1；白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)的引物由上海生物工程股份有限公司合成；小鼠基礎飼糧購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，其營養(yǎng)水平如表1所示，該飼糧為全價飼糧，由玉米、豆粕、魚粉、面粉、麩皮、碳酸氫鈣、石粉、多種維生素、多種微量元素、多種氨基酸等組成，試驗飼糧為基礎飼糧中添加10 g/kg PP。

表1 基礎飼糧的營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) g/kg

1.2 試驗設計

將40只健康無特定病原體(SPF級)雄性ICR小鼠(年齡5～6周齡，體重25～27 g)隨機分為4組，每組10只。小鼠圈養(yǎng)在溫度和濕度均可控的環(huán)境中，室溫在(21±2) ℃，相對濕度在40%～60%。小鼠自由采食、飲水1周，使其適應環(huán)境，消除應激。7 d后進入試驗期，試驗期為21 d。小鼠分組情況如下：1)對照(C)組：試驗期飼喂基礎飼糧，第18～20天14:00每天每只小鼠灌服無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)0.2 mL；2)ETEC組：試驗期飼喂基礎飼糧，第18～20天14:00每天每只小鼠灌服ETEC K88(濃度為5.0×109CFU/mL)0.2 mL；3)PP組：試驗期飼喂試驗飼糧，第18～20天14:00每天每只小鼠灌服無菌PBS 0.2 mL；4)ETEC+PP組：試驗期飼喂試驗飼糧，第18～20天14:00每天每只小鼠灌服ETEC K88(濃度為5.0×109CFU/mL)0.2 mL。

試驗于第21天對小鼠進行乙醚麻醉，在處死前對全部小鼠進行眼球摘取采血，靜置30 min后，4 ℃的條件下3 000 r/min離心10 min，用于制備血清；再脫頸處死，取小鼠的肝臟、脾臟，同時取小鼠結腸組織，用PBS漂洗干凈后，放入液氮中快速封存，再置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 臨床表現(xiàn)觀察及疾病活動指數(shù)評估

灌服菌液后，每天觀察并記錄小鼠活動、精神狀態(tài)、呼吸、毛發(fā)及腹瀉等情況，并于第21天處死，取樣前對小鼠臨床表現(xiàn)進行評分。小鼠ETEC感染后疾病活動指數(shù)評估標準[11]如表2所示。

表2 小鼠ETEC感染后疾病活動指數(shù)評估標準Table 2 Disease activity indexes of mice infected with ETEC

1.4 臟器指數(shù)測定

在小鼠宰前進行稱重，脫頸處死后，立即取出肝臟和脾臟，用PBS沖洗并用濾紙吸干表面水分后精確稱重、記錄。計算公式如下：

臟器指數(shù)(mg/g)=器官重量(mg)/活體重量(g)。

1.5 血清生化指標測定

血清生化指標谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)活性由黑龍江省哈爾濱市省醫(yī)院協(xié)同檢測完成，使用Beckman Coulter美國全自動生化分析儀(UnicelDxC800 Synchron Clinical System)分析。

1.6 血清及肝臟抗氧化指標測定

血清及肝臟抗氧化指標采用南京建成生物工程研究所的抗氧化試劑盒進行檢測，取各組小鼠的血清及肝臟組織，按照試劑盒說明書檢測方法測定樣本T-AOC及CAT活性。

1.7 腸道與肝臟組織炎癥因子表達水平測定

將組織樣品稱取0.1 g左右于研磨管中，加入1 mL Trizol，振蕩溶解。冰上靜置15 min，4 ℃條件離心；加入氯仿后振蕩離心分相，經(jīng)異丙醇及75%無水乙醇沉淀及洗滌，干燥后加入70 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解；以提取的總RNA為模板，將RNA進行反轉錄。反轉錄體系為10 μL，總RNA為2.5 μL，反轉錄條件為37 ℃，15 min及85 ℃ 5 s。RT產(chǎn)物cDNA放于-20 ℃保存。然后進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1βmRNA相對表達水平情況，所用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表3。qRT-PCR反應采用SYBR Green Real-Time PCR進行。反應體系為10 μL，配好混合液進行反應。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt方法計算各目的基因的相對表達量。

表3 實時熒光定量PCR引物序列Table 3 Quantitative real-time PCR primer sequence

1.8 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016初步處理，SPSS 26.0分析數(shù)據(jù)，用Duncan氏法檢驗進行多組間差異顯著性分析，數(shù)據(jù)均為平均值±標準差。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 PP對ETEC感染小鼠疾病活動指數(shù)的影響

如圖1所示，在第1～4天時，C組及PP組無明顯癥狀，疾病活動指數(shù)未見明顯上升；灌服ETEC后，ETEC組小鼠逐漸顯現(xiàn)出精神萎靡、反應遲緩、采食量降低以及活動減弱等癥狀，疾病活動指數(shù)迅速升高；而ETEC+PP組疾病活動指數(shù)增長相對緩慢，在第3天時，ETEC+PP組疾病活動指數(shù)顯著低于ETEC組(P<0.05)，在第4天時，無顯著性差異(P>0.05)。這表明采食添加0.1% PP的飼糧一定程度上能緩解灌服ETEC小鼠的應激反應。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。Different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.圖1 PP對小鼠感染ETEC后疾病活動指數(shù)的影響Fig.1 Effects of PP on disease activity indexes of mice infected with ETEC

2.2 PP對ETEC感染小鼠臟器指數(shù)的影響

如表4所示，較于C組，ETEC極顯著提高了小鼠的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)(P<0.01)；ETEC+PP組的小鼠其肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)相比于ETEC組極顯著降低(P<0.01)。這表明PP具有減輕小鼠腸道炎癥代謝器官損傷的作用。

表4 PP對ETEC感染小鼠臟器指數(shù)的影響Table 4 Effects of PP on organ indexes in mice infected with ETEC mg/g

2.3 PP對ETEC感染小鼠血清生化指標的影響

如表5所示，與ETEC組相比，ETEC+PP組血清AST及ALT活性略有下降，但無顯著性差異(P>0.05)。與C組相比，ETEC組血清T-AOC及CAT活性極顯著降低(P<0.01)，而ETEC+PP組則極顯著地改善了這種情況(P<0.01)。結果表明，灌服ETEC后，血清抗氧化平衡遭到破壞，抗氧化能力顯著降低，PP可以增強機體抗氧化能力，恢復血清抗氧化平衡。

表5 PP對ETEC感染小鼠血清生化指標的影響Table 5 Effects of PP on serum biochemical indexes in mice infected with ETEC

2.4 PP對ETEC感染腸道炎癥小鼠肝臟抗氧化指標的影響

如表6所示，與C組相比，ETEC組肝臟中的CAT活性和T-AOC均有降低的趨勢(P>0.05)，而ETEC+PP組的這些指標均有升高的趨勢，但無顯著差異(P>0.05)

表6 PP對ETEC感染小鼠肝臟抗氧化指標的影響Table 6 Effects of PP on antioxidant indexes in liver of mice infected with ETEC U/mg prot

2.5 PP對ETEC感染小鼠腸道和肝臟炎性細胞因子表達水平的影響

由圖2可知，ETEC組小鼠腸道中IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA相對表達量均顯著高于C組(P<0.05)，同時，ETEC+PP組的IL-6和IL-1βmRNA相對表達量顯著低于ETEC組(P<0.05)，TNF-αmRNA相對表達量相較于ETEC組無顯著性差異(P>0.05)。總的來說，PP可以降低ETEC引起的小鼠腸道組織促炎因子的表達增加，減輕腸道炎癥。

圖2 PP對ETEC攻毒小鼠腸道炎性細胞因子mRNA相對表達量的影響Fig.2 Effects of PP on mRNA relative expression levels of inflammatory cytokines in intestinal tract of mice with ETEC

由圖3可知，ETEC組小鼠肝臟中IL-6、TNF-α及IL-1βmRNA相對表達量均顯著高于C組(P<0.05)，而ETEC+PP組的IL-6、TNF-α及IL-1βmRNA相對表達量顯著低于ETEC組(P<0.05)，這表明PP能有效抑制肝臟炎性細胞因子釋放，緩解肝臟炎癥。

圖3 PP對ETEC攻毒小鼠肝臟炎性細胞因子mRNA相對表達量的影響Fig.3 Effects of PP on mRNA relative expression levels of inflammatory cytokines in live of mice with ETEC

3 討 論

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌ETEC是一種重要的人畜共患病原體，通常會感染幼年畜禽，引起敗血癥、腸炎和畜禽死亡等情況，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。以往對于ETEC感染的預防及治療多依賴于抗生素。然而，由于抗生素濫用造成的耐藥性及殘留等隱患危害著畜禽產(chǎn)品的生物安全，我國已全面禁止飼料中添加抗生素，抗生素替代產(chǎn)品的開發(fā)迫在眉睫。近年來，開發(fā)功能性飼料添加劑從而促進動物生長、預防病原菌感染以及改善動物腸道健康成為研究熱點。值得關注的是，來源于天然植物提取物的植物多糖，其作為飼料添加劑不僅可以提供糖類、氨基酸、纖維素、維生素等營養(yǎng)素，還具有抑制細菌生長、調(diào)節(jié)腸道菌群、增強機體免疫力、抗氧化等作用，有望成為飼料中理想的抗生素替代物。本研究采用灌服大腸桿菌ETEC K88建立腸炎模型[12-13]，以探究PP對小鼠腸道損傷的保護作用及其機制。

ALT和AST是肝臟細胞內(nèi)重要的氨基轉移酶及代謝酶[14]。肝臟受損時，血清中ALT和AST活性會明顯升高[15-16]。因此，血清中ALT和AST活性在一定程度上可以反映肝臟細胞損傷情況。研究結果顯示，健康SPF級雄性ICR小鼠灌服產(chǎn)腸毒素大腸桿菌后，雖然肝臟沒有明顯的病理現(xiàn)象，但血清中ALT、AST活性升高，肝臟指數(shù)顯著上升，而飼喂0.1% PP試驗飼糧(ETEC+PP組)的小鼠肝臟指數(shù)及血清中ALT、AST活性相較于ETEC組均顯著下降。李毅騰等[17]研究證實了PP的提取物對于糖尿病大鼠血清AST、ALT活性具有顯著的改善作用。本試驗結果表明，PP可以通過降低血清關鍵轉氨酶活性來緩解ETEC對肝臟功能的損傷，對動物機體具有一定的保護作用。

CAT活性及T-AOC是評價動物機體抗氧化能力的常用指標，當機體受到損傷時，血清及組織抗氧化平衡遭到破壞，抗氧化能力降低[18]。感染產(chǎn)腸毒素ETEC K88的小鼠肝臟以及血清中T-AOC及CAT的活性降低，說明其機體抗氧化與氧化系統(tǒng)的平衡被破壞，這可能進一步加劇組織和細胞的損傷。而ETEC+PP組小鼠血清CAT活性和T-AOC相較于ETEC組顯著升高。宋麗君等[19]研究發(fā)現(xiàn)，PP灌胃小鼠血清CAT活性極顯著增加。以上結果表明，PP可以通過提高自由基清除系統(tǒng)的活性來平衡機體代謝過程中不斷產(chǎn)生的自由基，使得機體免受ETEC感染引起的抗氧化機能損傷。

小鼠的腸道炎癥反應往往伴隨促炎細胞因子釋放的增加，所以小鼠腸道炎癥的嚴重程度可通過檢測促炎細胞因子(包括IL-6、TNF-α和IL-1β)的表達水平來評估。本試驗結果表明，灌胃ETEC后，ETEC組小鼠肝臟以及腸道IL-6、TNF-α以及IL-1β的mRNA相對表達量顯著增加，ETEC+PP組小鼠炎性細胞因子mRNA相對表達量較ETEC組顯著下降，表明PP可以有效抑制IL-6、TNF-α以及IL-1βmRNA相對表達量，說明PP具有一定的抗炎作用。

在動物生產(chǎn)中，黃芪多糖、白術多糖、牛膝多糖等多糖可在一定程度替代抗生素保護腸道免受損傷[20]。值得注意的是，不僅在傳統(tǒng)意義上的藥用植物，在非藥用植物中也有大量多糖在動物生產(chǎn)中應用，例如海藻多糖、苜蓿多糖等。但是目前對于PP作為一種新型添加劑應用于飼糧卻鮮有報道。PP具有多重生物功能，與硒化枸杞多糖相比，PP具有更明顯的保護肝臟的能力[21]。研究發(fā)現(xiàn)，PP消化率更高，不僅具有抗炎作用，還可以抗腫瘤[22-23]，并且南瓜來源廣泛，價格低廉[24]。因此，相較于其他多糖，PP有更為廣闊的應用前景。

4 結 論

本試驗通過灌胃ETEC K88感染小鼠建立腸道炎癥模型，研究PP對小鼠血清生化指標、血清及肝臟抗氧化指標以及腸道和肝臟炎癥因子表達的影響，探究PP對動物腸道的保護作用及其機制。結果發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加PP對ETEC感染小鼠機體損傷有一定的保護作用，并且提高了機體抗氧化能力，使機體免受ETEC感染引起的抗氧化機能損傷，同時，PP可抑制腸道及肝臟炎癥因子的表達，對動物機體炎癥反應具有緩解作用。