楊金芬 馬存霞 李毓敏 杜雪燕 郝力壯 項(xiàng) 洋 拜彬強(qiáng)*

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016；2.青海省飼草料技術(shù)推廣站，西寧 810016；3.青海省高原放牧家畜動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016)

光譜技術(shù)作為一種新技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、石油化工等行業(yè)的質(zhì)量控制。其中近紅外光譜(near infrared spectroscopy，NIRS)技術(shù)主要應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的定量與定性[1-4]，該技術(shù)的應(yīng)用基于樣本組分對(duì)近紅外光譜的吸收特性，這種吸收特性取決于植物組織有機(jī)物中所含的C-H、O-H及N-H等化學(xué)鍵對(duì)特定波長(zhǎng)光譜的吸收。當(dāng)樣品接受近紅外光掃描時(shí)，由于化學(xué)鍵對(duì)能量的吸收能力不同，樣品分子的振動(dòng)也不同，從而產(chǎn)生特異的光譜數(shù)據(jù)。人們通過將測(cè)定的光譜數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)室實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，并建立模型，就能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)樣品的營(yíng)養(yǎng)成分含量。

近紅外光譜技術(shù)應(yīng)用于牧草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)具有快速、無損、成本低等優(yōu)點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外采用近紅外光譜技術(shù)與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合的方法建立預(yù)測(cè)模型，從而對(duì)牧草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行快速測(cè)定的研究越來越廣泛。在國(guó)外，近紅外光譜預(yù)測(cè)模型的應(yīng)用起步較早，在20世紀(jì)70年代，Norris等[5]就采用近紅外光譜技術(shù)測(cè)定了玉米植株的粗蛋白質(zhì)(CP)含量，效果理想。在此研究的基礎(chǔ)上，近紅外光譜技術(shù)在牧草CP、粗脂肪(EE)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)等營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定中的應(yīng)用研究大量展開。利用近紅外光譜預(yù)測(cè)模型針對(duì)玉米植株、羊草、光花披堿草、多花黑麥草、臂形草等的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行預(yù)測(cè)，效果均比較理想[6-11]。我國(guó)近紅外光譜技術(shù)起步較晚，在牧草上的應(yīng)用研究開始于20世紀(jì)90年代。目前，針對(duì)苜蓿、羊草、百里香、針茅、苔草、羊茅、菊苣等牧草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定的近紅外光譜預(yù)測(cè)模型均已見報(bào)道[12-15]。

綜上所述，近紅外光譜技術(shù)主要應(yīng)用于牧草的CP、NDF和ADF等常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的預(yù)測(cè)，且預(yù)測(cè)效果準(zhǔn)確。近紅外光譜技術(shù)在牧草中的應(yīng)用研究主要集中在豆科牧草和禾本科牧草等單一牧草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定上，特別是在苜蓿、黑麥草及玉米植株的研究更為廣泛深入，而針對(duì)天然草地上的混合牧草的研究鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)采用近紅外光譜技術(shù)與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合的手段，探索近紅外光譜技術(shù)應(yīng)用于天然混合牧草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定的可行性，并初步構(gòu)建三江源東部地區(qū)天然混合牧草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的近紅外光譜預(yù)測(cè)模型，一方面為建立起高原快速、準(zhǔn)確、無污染的新型牧草品質(zhì)評(píng)價(jià)體系奠定基礎(chǔ)；另一方面為高原天然混合牧草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值數(shù)據(jù)庫(kù)增加數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

天然混合牧草樣品采集于青海省三江源東部地區(qū)黃南藏族自治州澤庫(kù)縣寧秀鄉(xiāng)寧秀村(80份，優(yōu)勢(shì)種為披堿草、蓬子菜、小花草玉梅、畫眉草)、海南藏族自治州同德縣塘古鎮(zhèn)塞唐村(30份，優(yōu)勢(shì)種為高山嵩草、麻花艽、長(zhǎng)毛風(fēng)毛菊)和秀麻鄉(xiāng)木合村(110份，優(yōu)勢(shì)種為高山嵩草、金露梅、披堿草、長(zhǎng)毛風(fēng)毛菊)、果洛藏族自治州瑪沁縣大武鎮(zhèn)吾瑪村(81份，優(yōu)勢(shì)種為高山嵩草、羊草、披堿草、長(zhǎng)毛風(fēng)毛菊)，共計(jì)301份。在青草期(2020年7月)，選擇未經(jīng)放牧、無退化情況、牧草長(zhǎng)勢(shì)良好的天然草場(chǎng)，采用1 m×1 m的樣方框進(jìn)行樣點(diǎn)的隨機(jī)拋選，然后用剪刀齊地剪割樣方框內(nèi)的所有牧草。牧草采集完成后，挑出牧草中的有毒牧草、動(dòng)物糞便、石頭等不可食部分，自然風(fēng)干，粉碎，過1 mm篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 牧草化學(xué)成分測(cè)定

CP含量參照AOAC(1995)中的凱氏定氮法，采用凱氏定氮儀(Kjeltec2100 Distillation Unit，F(xiàn)oss Tecator公司，丹麥)測(cè)定，CP含量=氮含量×6.25[16]；NDF和ADF含量參照Van Soest等[17]的方法，采用全自動(dòng)纖維分析儀(ANKOM 2000i，ANKOM Technology公司，美國(guó))測(cè)定。每個(gè)指標(biāo)測(cè)定重復(fù)2次，取平均值進(jìn)行模型擬合。

1.3 近紅外光譜掃描

牧草近紅外光譜值采用近紅外光譜儀(DS2500，F(xiàn)oss公司，丹麥)進(jìn)行光譜掃描。掃描前，近紅外光譜儀預(yù)熱30 min左右，并進(jìn)行校準(zhǔn)。將處理好的樣品裝入樣品杯進(jìn)行掃描，樣品量約為杯容量的3/4，每個(gè)樣品重復(fù)掃描3次，每次均掃描背景，將平均光譜保存為樣品的最終光譜，從而消除由裝樣緊實(shí)度以及樣品粒度不同所造成的誤差。在樣品掃描的過程保持周圍環(huán)境的安靜，全程1個(gè)人操作，盡最大可能減少誤差。近紅外光譜掃描條件為：波長(zhǎng)400.0～2 498.2 nm，檢測(cè)器由硅檢測(cè)器(波長(zhǎng)400.0～1 092.8 nm)和硫化鉛檢測(cè)器(波長(zhǎng)1 100.0～2 498.2 nm)構(gòu)成；掃描頻率為2次/s；光譜分辨率為0.5 nm；波長(zhǎng)準(zhǔn)確度<0.05 nm。光譜值表示為log(1/R)。

1.4 近紅外光譜預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建與驗(yàn)證

將301個(gè)樣品按照7∶3的比例隨機(jī)分為定標(biāo)集(226個(gè))和驗(yàn)證集(75個(gè))。定標(biāo)集用于模型的構(gòu)建及交叉驗(yàn)證，驗(yàn)證集用于模型的外部驗(yàn)證。采用WinISI Ⅲ進(jìn)行定標(biāo)分析。首先對(duì)定標(biāo)集近紅外光譜值進(jìn)行主成分分析(PCA)，進(jìn)行異常值剔除，采用的方法為馬氏距離法，利用每個(gè)樣品的得分與所有樣品得分平均值(作為中心點(diǎn))進(jìn)行比較來計(jì)算馬氏距離，將馬氏距離大于3(標(biāo)準(zhǔn)變異單位的3倍)的近紅外光譜值作為異常值剔除。然后分別采用平滑處理(smoothing)、求導(dǎo)處理[一階求導(dǎo)(1st Deriv)和二階求導(dǎo)(2st Deriv)]和光散射校正[(多元離散校正(MSC)和標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)化處理(SNV)]幾種單一預(yù)處理方法組合成7種復(fù)合預(yù)處理方法對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理：二階求導(dǎo)+平滑處理、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)化處理+去散射處理+一階求導(dǎo)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)化處理+去散射處理+二階求導(dǎo)、多元離散校正+一階求導(dǎo)、多元離散校正+二階求導(dǎo)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)化處理+一階求導(dǎo)，根據(jù)定標(biāo)及交叉驗(yàn)證的各項(xiàng)參數(shù)[交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)誤差(cross-verify standard errors，SECV)最小，交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(cross-verify correlation coefficients，1-VR)最大)]篩選出最佳數(shù)據(jù)預(yù)處理方法。采用修正偏最小二乘法(modified partial least squares，MPLS)對(duì)預(yù)處理完成的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，構(gòu)建牧草CP、NDF和ADF含量的預(yù)測(cè)模型，并通過交叉驗(yàn)證及外部驗(yàn)證對(duì)構(gòu)建的模型進(jìn)行驗(yàn)證和評(píng)價(jià)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)簡(jiǎn)單統(tǒng)計(jì)，SAS 9.3軟件PROC MEANS程序進(jìn)行成對(duì)數(shù)據(jù)的t檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 天然混合牧草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值測(cè)定

由表1可知，驗(yàn)證集樣本的CP、NDF和ADF含量均在定標(biāo)集樣本的范圍內(nèi)。所有樣本的CP、NDF和ADF含量存在一定差異，定標(biāo)集和驗(yàn)證集的最大值、最小值、平均值和標(biāo)準(zhǔn)差都比較接近。所有樣本的CP、NDF和ADF平均含量為13.74%、44.87%和25.26%。

表1 三江源東部地區(qū)天然混合牧草的營(yíng)養(yǎng)成分(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Nutritional composition of natural mixed forage in eastern region of three-rivers source (air-dry basis) %

2.2 天然混合牧草的近紅外光譜分析

天然混合牧草原始近紅外光譜見圖1，光譜掃描的波長(zhǎng)為400.0～2 498.2 nm，每隔0.5 nm得到1個(gè)吸光值。在同一波長(zhǎng)處，所有樣品的吸光度有一定的波動(dòng)范圍，這主要是因?yàn)闃悠穪碓从谌礀|部不同地區(qū)的不同草場(chǎng)。牧草吸光度在可見光和近紅外光波段的多個(gè)波長(zhǎng)處存在峰值，特別是在可見光區(qū)域的400～700 nm處存在2個(gè)明顯的吸收峰，這主要是因?yàn)槟敛輼悠凡杉谇嗖萜?，此時(shí)牧草富含葉綠素，葉綠素對(duì)于可見光中的藍(lán)紫光和紅光有較強(qiáng)的吸收能力。同樣在設(shè)定的光譜范圍內(nèi)，對(duì)應(yīng)有多個(gè)谷值。光譜中的峰值與牧草中化學(xué)鍵的種類有關(guān)，是牧草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值預(yù)測(cè)模型構(gòu)建的關(guān)鍵。此外，在1 092.8～1 100.0 nm處存在一個(gè)很窄的斷帶，這是因?yàn)楸狙芯克玫慕t外光譜儀搭載的是雙檢測(cè)器，2個(gè)檢測(cè)器的分界處形成了很小的空隙，是斷帶形成的根本原因。

圖1 三江源東部地區(qū)天然混合牧草原始近紅外光譜Fig.1 Original near infrared spectroscopy of natural mixed forage in eastern region of three-rivers source

2.3 定標(biāo)模型的構(gòu)建及交叉驗(yàn)證

表2 最佳數(shù)據(jù)預(yù)處理?xiàng)l件下定標(biāo)及交叉驗(yàn)證的參數(shù)Table 2 Parameters for calibration and cross-validation under optimal data pre-processing conditions

2.4 近紅外光譜模型預(yù)測(cè)效果評(píng)價(jià)

表3 定標(biāo)模型的外部驗(yàn)證參數(shù)Table 3 External validation parameters of calibration model

由圖2、圖3和圖4可知，將驗(yàn)證集樣品CP、NDF和ADF的化學(xué)實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值做回歸分析發(fā)現(xiàn)，擬合度較好，決定系數(shù)(R2)均高于0.900 0。

圖2 CP含量的化學(xué)實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值的回歸分析Fig.2 Regression analysis of chemical measured value and model prediction value of CP content

圖3 NDF含量的化學(xué)實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值的回歸分析Fig.3 Regression analysis of chemical measured value and model prediction value of NDF content

圖4 ADF含量的化學(xué)實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值的回歸分析Fig.4 Regression analysis of chemical measured value and model prediction value of ADF content

3 討 論

近紅外光譜技術(shù)在牧草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定上的研究歷史不足50年，但針對(duì)各類單一牧草的CP、EE、NDF和ADF等營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定的近紅外光譜預(yù)測(cè)模型已經(jīng)紛紛建立，由于具有快速、無損及成本低等特點(diǎn)，目前被廣泛引用于實(shí)際生產(chǎn)。本研究在此基礎(chǔ)上以三江源東部地區(qū)青草期天然混合牧草為對(duì)象，擬構(gòu)建天然混合牧草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的近紅外光譜預(yù)測(cè)模型。

本研究中采集的天然混合牧草樣品CP、NDF和ADF的平均含量分別為13.74%、44.87%和25.26%。所采集的牧草樣品營(yíng)養(yǎng)成分存在一定差異，這與天然混合牧草樣品采集的地點(diǎn)不同有關(guān)，也與牧草組成種類有關(guān)，這種差異也為預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建提供了保障。近紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)存在若干峰值和谷值，這些差異為預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建提供了保障。在近紅外光譜分析中發(fā)現(xiàn)了一條很窄的斷帶，經(jīng)分析這是2個(gè)檢測(cè)器的分界處形成的空隙，對(duì)于預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建無任何影響。

在構(gòu)建預(yù)測(cè)模型時(shí)對(duì)近紅外光譜值進(jìn)行了7種預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過預(yù)處理的數(shù)據(jù)構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型要優(yōu)于未經(jīng)處理的數(shù)據(jù)。本研究中，CP預(yù)測(cè)模型構(gòu)建中數(shù)據(jù)預(yù)處理的最佳方法為標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)化處理+去散射處理+二階求導(dǎo)。這與劉哲等[18]構(gòu)建錫林郭勒盟草原天然混合牧草CP預(yù)測(cè)模型時(shí)的最佳數(shù)據(jù)預(yù)處理方法一致；楊天輝等[15]研究也發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)化處理+去散射處理+二階求導(dǎo)是構(gòu)建除豆科、禾本科之外牧草CP預(yù)測(cè)模型的最佳數(shù)據(jù)預(yù)處理方法。本研究中，NDF和ADF預(yù)測(cè)模型構(gòu)建中數(shù)據(jù)預(yù)處理的最佳方法均為多元離散校正+二階求導(dǎo)，這與以往牧草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值預(yù)測(cè)模型構(gòu)建中的數(shù)據(jù)預(yù)處理方法不同，但在本研究中預(yù)測(cè)模型構(gòu)建效果最佳。

4 結(jié) 論

CP預(yù)測(cè)模型構(gòu)建中數(shù)據(jù)預(yù)處理的最佳方法為標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)化處理+去散射處理+二階求導(dǎo)，NDF和ADF預(yù)測(cè)模型構(gòu)建中數(shù)據(jù)預(yù)處理的最佳方法為多元離散校正+二階求導(dǎo)。經(jīng)數(shù)據(jù)預(yù)處理，本試驗(yàn)構(gòu)建出了較為理想的三江源東部地區(qū)天然混合牧草的CP、NDF和ADF預(yù)測(cè)模型，交叉驗(yàn)證和外部驗(yàn)證表明，試驗(yàn)構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)效果較好，可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。