楊烜懿 宋紫菱 植心妍 趙旭民 王光輝 遲淑艷* 譚北平*

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料實驗室，湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)動物精準(zhǔn)營養(yǎng)高效飼料工程研究中心，湛江 524088；3.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室(湛江)，湛江 524025；4.宜昌華太生物科技有限公司，宜昌 443500)

魚粉(FM)具有蛋白質(zhì)含量高、氨基酸(AA)組成平衡、富含不飽和脂肪酸、抗?fàn)I養(yǎng)因子含量低等優(yōu)點，是水產(chǎn)動物尤其是肉食性魚類的最佳蛋白質(zhì)來源。魚粉資源緊缺，導(dǎo)致價格不斷攀升，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的成本壓力，嚴(yán)重限制了水產(chǎn)飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的快速、可持續(xù)發(fā)展。盡管應(yīng)用糧源性蛋白質(zhì)飼料替代魚粉在養(yǎng)殖動物上取得了較好效果[1]，一定程度緩解了因魚粉的高額成本帶來的經(jīng)濟壓力。然而，隨著人們生活水平的提高，動物性食品的占比逐年升高，人畜爭糧日益嚴(yán)重，據(jù)推測，未來10年間，糧食單產(chǎn)的提升速度遠(yuǎn)不及飼用糧需求的增長速度[2]。糧食需求量的剛性增長，以及人們對動物性食品的需求，要求最大程度減少飼料工業(yè)對糧源性蛋白質(zhì)飼料的依賴[3]。充分開發(fā)、高效利用非糧蛋白質(zhì)源替代魚粉對飼料工業(yè)，尤其是水產(chǎn)飼料行業(yè)的發(fā)展具有重大意義。

2020年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒顯示，海水養(yǎng)殖魚類中，石斑魚產(chǎn)量達(dá)18.31萬 t，位居第二[20]。珍珠龍膽石斑魚是石斑魚養(yǎng)殖的主要品種之一，具有抗病力強、肉質(zhì)鮮美、經(jīng)濟效益高、生長速度快和發(fā)展?jié)摿Υ蟮忍攸c[21]。魚粉替代技術(shù)及石斑魚產(chǎn)品品質(zhì)的改善均影響著石斑魚產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展。因此，本試驗以珍珠龍膽石斑魚為研究對象，探究非糧蛋白源EP替代魚粉對珍珠龍膽石斑魚肌肉品質(zhì)及肌肉生長相關(guān)基因表達(dá)的影響，為開拓非糧蛋白質(zhì)源的使用，研制石斑魚資源節(jié)約型配合飼料提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

魚粉和酶解雞肉粉(100%來源于雞脛骨肌肉，由宜昌某生物技術(shù)有限公司提供)的概略營養(yǎng)組成見表1，酶解雞肉粉的肽分子質(zhì)量分布見圖1。配制以0(EP0組，作為對照組)、3%(EP3組)、6%(EP6組)、9%(EP9組)、12%(EP12組)、15%(EP15組)和18%(EP18組)酶解雞肉粉等量替代魚粉的7種等氮等脂的試驗飼料。飼料原料經(jīng)粉碎后，通過60目篩，按照表2準(zhǔn)確稱量，通過V型立式混合機(JS-14S型，浙江正泰電器股份有限公司)充分?jǐn)嚢?，加入預(yù)先稱重的豆油、大豆磷脂、魚油和水，二次攪拌混合，用膨化機制得直徑為3.00 mm的顆粒。將顆粒飼料置于25 ℃空調(diào)房干燥48 h，直至水分含量約為10%，后儲存于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 魚粉和酶解雞肉粉的概略營養(yǎng)組成(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Proximate nutrient composition of the FM and EP (DM basis) %

表2 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) %

續(xù)表2項目 ItemsEP0EP3EP6EP9EP12EP15EP18營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)水分 Moisture10.2710.5310.2510.7410.0410.2910.22粗蛋白質(zhì) Crude protein49.8249.4149.6550.0450.1349.9150.03粗脂肪 Ether extract10.4810.3510.5910.5110.6910.7410.90粗灰分 Ash9.399.239.038.738.428.127.82

圖1 酶解雞肉粉的肽分子質(zhì)量分布Fig.1 Peptide molecular weight distribution of EP

1.2 試驗用魚及飼養(yǎng)管理

珍珠龍膽石斑魚幼魚購自廣東省湛江市東南碼頭石斑魚苗廠，魚苗購回后在廣東省湛江海洋高新科技園室外水泥池暫養(yǎng)2周，期間投喂石斑魚商業(yè)飼料(廣東粵海飼料集團，CP含量為50%)。養(yǎng)殖試驗開始前，禁食24 h后將630尾初均重為(7.50±0.02) g的珍珠龍膽石斑魚隨機放養(yǎng)于21個玻璃鋼桶(300 L)，每桶30尾魚，每種試驗飼料投喂3桶。每天表觀飽食投喂2次(08:00和16:00)，共計56 d。并根據(jù)天氣變化及吃料情況調(diào)整投喂量。每天每個玻璃鋼桶中更換約70%的水。養(yǎng)殖期間，養(yǎng)殖水體溫度為30.80～31.80 ℃，鹽度為29～32，溶解氧含量高于6.15 mg/L，pH為6.80～7.20。

1.3 樣品收集與分析

1.3.1 肌肉及飼料營養(yǎng)成分含量測定

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，每桶隨機收集3尾石斑魚的背肌，儲存于-20 ℃，以檢測肌肉營養(yǎng)成分含量。使用AOAC(1997)[22]方法分析飼料和肌肉的營養(yǎng)成分含量。105 ℃恒重干燥法測定水分含量；索氏抽提法(抽提劑為石油醚)測定粗脂肪EE含量；凱氏定氮法(KjeltecTM8400定氮儀，瑞典)測定CP含量；550 ℃灼燒法(馬弗爐)測定粗灰分含量。飼料中氨基酸組成按照GB/T 18246—2000[23]進行測定。肌肉中氨基酸組成按照GB 5009.124—2016[24]進行測定，脂肪酸組成按照GB 5009.168—2016[25]進行測定。EP的肽分子量分布采用《海洋魚低聚肽粉》(GB/T 22729—2008)[26]進行檢測。

1)維生素預(yù)混料和礦物質(zhì)預(yù)混料由青島瑪斯特生物技術(shù)有限公司提供Vitamin premix and mineral premix were provided byQingdaoMaster Biotech Co., Ltd.

2)實測值 measured values。

1.3.2 肌肉系水力及質(zhì)構(gòu)特性測定

隨機從每桶選擇3尾魚，取3.00～4.00 g背肌，準(zhǔn)確稱量，懸掛于充滿空氣的保鮮袋，于4 ℃冰箱懸吊24 h，再次稱重背肌重量，以計算滴水損失[27]；另取3.00～4.00 g背肌，用保鮮膜包裹密封，于100 ℃水浴鍋蒸煮5 min，冷卻至室溫，稱重以計算蒸煮損失[28]。隨機從每桶取6尾魚，剝離背肌，剪切為3.00 cm(長)×3.00 cm(寬)×1.00 cm(高)的規(guī)格，通過質(zhì)構(gòu)儀(TMS-PRO，F(xiàn)ood Technology Corporation，美國)對進行質(zhì)構(gòu)特性分析。

1.3.3 肌肉生長相關(guān)基因表達(dá)測定

表3 qRT-PCR引物序列Table 3 Primer sequences for qRT-PCR

1.4 計算公式

蒸煮損失(%)=(Wc1-Wc2)/Wc1；
滴水損失(%)=(Wd1-Wd2)/Wd1。

式中：Wc1是背肌蒸煮前重量(g)；Wc2是背肌蒸煮后重量(g)；Wd1是背肌懸掛靜置前重量(g)；Wd2是背肌懸掛靜置后重量(g)。

1.5 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均通過SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，用Tukey法進行多重比較。P<0.05表示差異顯著。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 酶解雞肉粉對珍珠龍膽石斑魚肌肉營養(yǎng)成分含量的影響

由表4可知，酶解雞肉粉替代不同比例魚粉對珍珠龍膽石斑魚背肌中水分、CP、EE和粗灰分含量沒有顯著影響(P>0.05)。

表4 飼喂不同飼料石斑魚的肌肉營養(yǎng)成分含量(濕重基礎(chǔ))Table 4 Muscle nutritional component contents of groupers fed different diets (wet weight basis) %

2.2 酶解雞肉粉對珍珠龍膽石斑魚肌肉系水力和質(zhì)構(gòu)特性的影響

由表5可知，酶解雞肉粉替代不同比例魚粉對珍珠龍膽石斑魚肌肉的內(nèi)聚性和彈性未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。EP6組的蒸煮損失顯著低于EP0、EP3、EP9和EP18組(P<0.05)。EP12、EP15和EP18組的滴水損失顯著低于EP3組(P<0.05)。EP6組的硬度與EP18組無顯著差異(P>0.05)，但顯著高于其他各組(P<0.05)。EP6組的膠黏性顯著高于EP0、EP12和EP15組(P<0.05)。EP6組的咀嚼性與EP0和EP18組無顯著差異(P>0.05)，但顯著高于其他各組(P<0.05)。

表5 飼喂不同飼料石斑魚的肌肉系水力和質(zhì)構(gòu)特性Table 5 Muscle water holding capacity and texture properties of groupers fed different diets

2.3 酶解雞肉粉對珍珠龍膽石斑魚肌肉氨基酸組成的影響

由表6可知，酶解雞肉粉替代不同比例魚粉對珍珠龍膽石斑魚肌肉中亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、蛋氨酸(Met)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、苯丙氨酸(Phe)、蘇氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、絲氨酸(Ser)以及總氨基酸、總必需氨基酸、總鮮味氨基酸和總芳香族氨基酸含量均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。EP0組纈氨酸(Val)含量顯著高于EP12組(P<0.05)。EP0和EP9組組氨酸(His)含量顯著高于EP18組(P<0.05)。EP0組脯氨酸(Pro)含量顯著高于EP18組(P<0.05)。

2.4 酶解雞肉粉對珍珠龍膽石斑魚肌肉脂肪酸組成的影響

由表7可知，隨著酶解雞肉粉替代魚粉比例的增加，珍珠龍膽石斑魚肌肉C15∶0、C17∶0、C20∶0和C16∶1n-7的含量逐漸上升，均在EP18組達(dá)到最大值，肌肉C22∶1n-9、C22∶6n-3(DHA)、∑MUFA、∑n-3 PUFA、總n-3高不飽和脂肪酸(∑n-3 HUFA)的含量及n-3/n-6 PUFA比值呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。EP9組C22∶1n-9含量顯著高于EP0、EP3、EP6和EP18組(P<0.05)。EP0組∑MUFA含量顯著低于EP12和EP15組(P<0.05)。EP3組n-3/n-6 PUFA比值及DHA、∑n-3 HUFA和∑n-3 PUFA含量顯著高于EP12、EP15和EP18組(P<0.05)。EP0、EP3和EP6組C24∶1n-9含量顯著高于EP15和EP18組(P<0.05)。肌肉中其余脂肪酸以及總飽和脂肪酸(∑SFA)、∑n-6 PUFA含量及EPA(C20∶5n-3)/DHA比值未受到酶解雞肉粉替代魚粉比例的影響(P>0.05)。

表7 飼喂不同飼料石斑魚的肌肉脂肪酸組成(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 7 Muscle fatty acid composition of groupers fed different diets (DM basis) %

2.5 酶解雞肉粉對珍珠龍膽石斑魚肌肉生長相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖2可知，珍珠龍膽石斑魚肌肉中肌源性分化因子(MyoD)和肌細(xì)胞增強因子2c(MEF-2c)、Ⅰ型膠原蛋白編碼基因α-2(Col1α-2)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、胰島素樣生長因子-2(IGF-2)的相對表達(dá)量受飼料影響不顯著(P>0.05)。EP6組肌細(xì)胞因子5(Myf5)和肌球蛋白重鏈(MyHC)的相對表達(dá)量顯著高于EP12、EP15和EP18組(P<0.05)。EP15組肌細(xì)胞生成素(MyoG)的相對表達(dá)量顯著高于EP0、EP3、EP6和EP9組(P<0.05)。EP0組肌細(xì)胞增強因子-2a(MEF-2a)的相對表達(dá)量顯著高于EP3、EP6和EP9組(P<0.05)。EP0組Ⅰ型膠原蛋白編碼基因α-1(Col1α-1)的相對表達(dá)量與EP12組無顯著差異(P>0.05)，但顯著高于其他各組(P<0.05)。EP0組卵泡抑素(FST)的相對表達(dá)量顯著低于其他各組(P<0.05)。EP0和EP3組肌肉生長抑制素(MSTN)的相對表達(dá)量顯著高于EP6組(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)。Value columns with different letters mean significant difference (P<0.05),while with the same letters or no letters mean no significant difference (P>0.05).圖2 飼喂不同飼料石斑魚的肌肉生肌調(diào)節(jié)因子(A)、編碼膠原蛋白(B)、肌肉生長正調(diào)控因子(C)和肌肉生長負(fù)調(diào)控因子(D)相對表達(dá)量Fig.2 Relative expression levels of myogenic regulatory factors (A), encoding collagens (B), positive regulators of muscle growth (C) and negative regulators of muscle growth (D) in muscle of groupers fed different diets.

3 討 論

肌肉作為被食用的主要部分，其營養(yǎng)成分含量則是影響品質(zhì)的重要因素[30]。在本試驗中，隨著酶解雞肉粉替代魚粉比例的增加，珍珠龍膽石斑魚肌肉中水分、CP、EE和粗灰分含量無顯著變化。在評價魚類肌肉營養(yǎng)價值的指標(biāo)中，蛋白質(zhì)尤為重要。氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本單元，其組成和含量的變化影響著肌肉的營養(yǎng)價值[31-32]。研究表明，珍珠龍膽石斑魚背肌中含量最豐富的氨基酸是Glu，其次是Asp、Lys和Leu[33-34]，本試驗中也發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)果。風(fēng)味是口腔的觸覺、味覺和嗅覺的復(fù)合感覺[35]，肌肉中必需氨基酸、鮮味氨基酸和芳香族氨基酸的含量與風(fēng)味密切相關(guān)[36]。Glu和Asp主要呈現(xiàn)的是鮮味，Gly和Ala呈現(xiàn)的是甜味，此外，Ser和Pro也與甜味的出現(xiàn)有關(guān)[37]。在本試驗中，隨著酶解雞肉粉替代魚粉比例的增加，必需氨基酸Val和His，總鮮味氨基酸及總芳香族氨基酸的含量均呈現(xiàn)下降趨勢，意味著酶解雞肉粉替代魚粉后，珍珠龍膽石斑魚肌肉的風(fēng)味可能會受到影響。

各組試驗飼料的EE含量保持不變，酶解雞肉粉中小肽的高效利用可以節(jié)約蛋白質(zhì)，充分發(fā)揮飼料中脂類的能量效應(yīng)，促進脂肪的分解，使得珍珠龍膽石斑魚肌肉脂肪酸組成發(fā)生變化[38]。有研究發(fā)現(xiàn)，不飽和脂肪酸(UFA)，尤其是PUFA，能夠改善肌肉的風(fēng)味[39]，肌肉的整體可接受程度及肉香味與C16∶1n-7含量呈正相關(guān)關(guān)系[40]。在本試驗中，隨著酶解雞肉粉替代魚粉比例的增加，肌肉C16∶1n-7含量呈現(xiàn)上升趨勢，MUFA、∑n-3 PUFA和∑n-3 HUFA含量呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，∑n-6 PUFA含量呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢。3%和6%酶解雞肉粉等量替代魚粉時，肌肉中∑n-3 PUFA和∑n-3 HUFA含量達(dá)到最大值。從上述結(jié)果可以得出，魚粉被酶解雞肉粉替代后，珍珠龍膽石斑魚肌肉的風(fēng)味會被改善，然而，肌肉中UFA含量增多，會存在被氧化的風(fēng)險，產(chǎn)生醇類或者醛類的復(fù)合物，使肌肉氣味變臭，影響肌肉品質(zhì)[41]。此外，較高水平的n-3 PUFA具有抗炎作用[42]，高水平的n-6 PUFA可以引起血管收縮、血小板聚集和炎癥反應(yīng)[43]。人類食物中n-3/n-6 PUFA比值的推薦值為0.10～0.25[44]，比值越低，人類患高脂血癥、肥胖癥和乳腺癌的風(fēng)險越高[45-46]。在本試驗中，珍珠龍膽石斑魚肌肉的n-3/n-6 PUHA比值為0.51～0.60。隨著酶解雞肉粉替代魚粉比例的增加，n-3/n-6 PUHA比值逐漸變小，逐步向食物最佳n-3/n-6 PUHA比值靠近。

系水力是衡量肌肉品質(zhì)的一個重要指標(biāo)，能夠反映肌肉中可溶性物質(zhì)及液態(tài)物質(zhì)的流失情況，對肌肉的營養(yǎng)成分的保留及風(fēng)味的保持具有重要意義[47]。硬度、內(nèi)聚性、彈性、膠黏性和咀嚼性是肌肉的主要質(zhì)構(gòu)特性[48]，不僅影響水產(chǎn)品的外觀，還影響口感。在本試驗中，當(dāng)6%酶解雞肉粉等量替代魚粉時，珍珠龍膽石斑魚肌肉的蒸煮損失顯著降低，硬度、膠黏性和咀嚼性均顯著提高，提示EP6組珍珠龍膽石斑魚肌肉的風(fēng)味及其營養(yǎng)物質(zhì)得到較好的保留，質(zhì)地較硬，更具有嚼勁。

生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)及其相關(guān)調(diào)節(jié)基因是影響肌肉品質(zhì)的內(nèi)因[49]，對肌原細(xì)胞分化、肌纖維發(fā)育以及肌肉組織的形成和生長具有重要的調(diào)節(jié)作用[50-51]。MRFs家族的表達(dá)具有時序性，在體細(xì)胞形成過程中，首先表達(dá)的是Myf5，其次是MyoD和MEF-2c，然后是MEF-2a和MyoG，最后是MyHC[52]。其中，Myf5和MyoD主要作為生肌決定因子[53]，MyoG在肌細(xì)胞分化中起著重要作用[54]。在本試驗中，6%酶解雞肉粉等量替代魚粉后，珍珠龍膽石斑魚肌肉中Myf5和MyHC的相對表達(dá)量顯著提高，改善了肌肉細(xì)胞的分化。IGF-1是一種重要的生長因子，在魚類肌肉中具有多種受體，能促進細(xì)胞活化、增殖和分化，是MRFs的正調(diào)節(jié)因子[55]。相反，IGF-2是MRFs的負(fù)調(diào)節(jié)因子[56]。在本試驗中，IGF-1和IGF-2的表達(dá)受飼料的影響不顯著。魚類肌肉中膠原蛋白的含量豐富，主要的膠原蛋白類型為Ⅰ型，由2條α-1鏈(Col1α-1)和1條α-2鏈(Col1α-2)編碼[57]。膠原蛋白的合成和交聯(lián)主要受TGF-β1調(diào)控，TGF-β1介導(dǎo)Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)[58]。在本試驗中，TGF-β1和Col1α-2的表達(dá)受飼料的影響不顯著，酶解雞肉粉替代魚粉后，下調(diào)了Col1α-1的表達(dá)，對膠原蛋白的形成產(chǎn)生負(fù)面影響。MSTN編碼肌肉生長抑制素蛋白，是肌肉生長的負(fù)調(diào)節(jié)因子[51]。FST可以抑制MSTN對肌肉生長的負(fù)調(diào)節(jié)作用，促進肌肉的生長發(fā)育[59]。飼料中魚粉被6%酶解雞肉粉等量替代后，珍珠龍膽石斑魚肌肉中MSTN的相對表達(dá)量顯著降低，F(xiàn)ST的相對表達(dá)量顯著提高，表明6%酶解雞肉粉等量替代魚粉有利于珍珠龍膽石斑魚肌肉的分化和生長，能夠提高肌肉的生長。

4 結(jié) 論

① 6%的酶解雞肉粉等量替代魚粉能夠顯著改善珍珠龍膽石斑魚肌肉的系水力和質(zhì)構(gòu)特性。

② 6%的酶解雞肉粉等量替代魚粉能夠顯著提高珍珠龍膽石斑魚肌肉中MRFs家族及肌肉生長正調(diào)控因子的表達(dá)，抑制肌肉生長負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)。