李文清 王瀟陽 李晨婉 張國只 趙亞寧 張宏祿 李萬利

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州 450002)

酪蛋白占牛奶總蛋白的80%，是新生兒氨基酸和磷酸鈣的主要來源。牛奶中有4種類型的酪蛋白：αS1、αS2、β和κ。眾所周知，κ-酪蛋白(κ-casein，CSN3)變異影響牛奶的工業(yè)生產(chǎn)特性，如乳濁狀態(tài)[1]。由于糖基化形式的存在，CSN3形成一個高度水合的聚電解質(zhì)層，具有空間和靜電穩(wěn)定性[2]。因此，CSN3是維持牛奶不透明狀態(tài)的重要物質(zhì)。

進化過程中，編碼酪蛋白的核苷酸序列保守性很差，在所有的酪蛋白中，CSN3的核苷酸序列相對最保守[3]。目前，奶牛CSN3研究主要集中在CSN3基因多態(tài)性與乳產(chǎn)量或乳成分之間的關(guān)系上[4-5]。但是，對于奶牛CSN3基因表達調(diào)控方面的研究比較少，而CSN3的基因調(diào)控與奶牛乳產(chǎn)量或乳成分也密切相關(guān)。作為一類小的非編碼RNA，miRNA可以在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達，影響多種生物學(xué)過程[6]，并且在奶牛的不同泌乳期，miRNA表達水平不同[7-8]。然而，還沒有關(guān)于miRNA和CSN3基因之間調(diào)節(jié)的報道。因此，本研究的目的是尋找調(diào)節(jié)奶牛CSN3表達的miRNA，以期為miRNA的功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 奶樣采集

采集中國荷斯坦奶牛3個泌乳階段的牛奶樣品，分別以產(chǎn)后60 d左右、產(chǎn)后120 d左右、產(chǎn)后240 d左右代表不同的泌乳階段。同一泌乳階段要求奶牛泌乳時間前后相差不超過10 d。具體方法為：選擇15頭奶牛，每個泌乳階段選擇5頭，每頭牛用50 mL離心管采集6管牛奶，當天將樣品四周冰袋覆蓋下運輸至實驗室。一部分樣品用于檢測牛奶中CSN3濃度；另一部分樣品放入離心機離心，用于從牛奶中分離體細胞(somatic cell，SC)。分離方法：4 ℃、600×g離心10 min，棄去上層物質(zhì)，沉淀即為體細胞。將分離出的體細胞加1 mL Trizol試劑，凍存于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)基因表達的研究。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測

采用牛CSN3的ELISA試劑盒(貨號：ml059486，上海酶聯(lián)生物科技有限公司)測定牛乳中CSN3濃度，方法參照試劑盒說明書。簡述如下：無菌管收集50 mL牛奶作為單個樣本，-80 ℃貯存?zhèn)溆谩颖驹? ℃、1 000×g下離心20 min，去除最上面的脂肪層。上清液用0.01 mol/L、pH=7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋10倍，之后進行ELISA試驗。CSN3的ELISA試劑盒內(nèi)含1套標準品，在450 nm處用光譜儀測定標準品光密度(OD)值，可以得到OD值與CSN3濃度的標準曲線。樣品中CSN3濃度可以通過測定OD值與標準曲線比較來確定。

1.3 乳腺組織樣品

分別于產(chǎn)后60 d、產(chǎn)后120 d和產(chǎn)后240 d對3頭健康荷斯坦奶牛的乳腺組織進行了3次活體取樣，具體方法參考Li等[9]。簡述如下：對采樣的乳腺部位進行局部麻醉，用滅菌的活體取樣器直接取樣，插入深度約為10 cm，1次能取3 g左右的樣品，用高壓滅菌的手術(shù)剪和鑷子將樣品切割為綠豆大小的小塊，放入1 mL凍存管，投入液氮中凍存。對手術(shù)部位進行消毒滅菌，縫合傷口，注射抗生素，手術(shù)后1周內(nèi)的牛奶棄去不用。奶牛飼喂全混合日糧，自由飲水。

1.4 小RNA測序和數(shù)據(jù)加工

乳腺組織RNA提取、小RNA測序和數(shù)據(jù)處理委托中國聯(lián)川生物公司開展。Trizol試劑提取RNA后，用生物分析儀2100(Agilent，美國)測定RNA的完整數(shù)(RIN)。在Illumina HiSeq 2500平臺上構(gòu)建了3個小RNA文庫(每個樣本1 μg)，用于單端測序(36或50 bp)。原始序列采用ACGT101-miR程序和miRBase 21.0過濾。通過校正計算對數(shù)據(jù)進行標準化處理，后續(xù)分析采用的均為標準化數(shù)據(jù)。低表達定義為所有樣本的拷貝數(shù)小于10的miRNA；中表達定義為1個樣本的拷貝數(shù)大于10，所有樣本的拷貝數(shù)小于平均值；高表達定義為至少1個樣本的拷貝數(shù)大于平均值。采用SAS 9.0的卡方檢驗(2×2)分析基于歸一化的差異表達miRNA。

1.5 靶向CSN3的miRNA預(yù)測

使用TargetScan 7.2(http://www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測靶向CSN3基因的miRNA。

1.6 交集篩選

將2種方法(小RNA測序分析和生物信息學(xué)軟件預(yù)測)交集篩選出miRNA作為下一步的研究對象。在差異表達miRNA中，刪除低表達或不在軟件預(yù)測范圍的miRNA。采用RNAhybrid(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)預(yù)測miRNA與CSN3-3’非編碼區(qū)(3’untranslated region，3’UTR)之間的結(jié)合自由能。

1.7 載體構(gòu)建

利用表1所示的引物，從?；蚪MDNA中擴增出CSN3-3’UTR的全長(207 bp)。將PCR產(chǎn)物克隆到psiCHECK-Ⅱ，利用NotI和XhoI限制性酶切位點構(gòu)建了psiCHECK-Ⅱ-CSN3-3’UTR質(zhì)粒。

表1 CSN3-3’UTR的引物Table 1 Primers for CSN3-3’UTR

1.8 熒光素酶報告基因分析

293T細胞接種于96孔板中，每孔接種密度為2×104個細胞。采用PmirGLO載體和psiCHECK-Ⅱ載體作為系統(tǒng)控制和測試控制。將4種miRNA模擬物(60 nmol/L)和陰性對照(中國銳博公司)分別與1 μg質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染試劑采用2 μL X-tremegene HP (羅氏公司，瑞士)。轉(zhuǎn)染48 h后，用雙熒光素酶報告試劑盒(E1910，Promega公司，美國)檢測熒光素酶活性。

1.9 CSN3、bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p的PCR檢測

應(yīng)用SYBR Prime Script RT-PCR試劑盒(TaKaRa，日本)測定牛奶體細胞中CSN3、bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p的相對表達量。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和U6分別作為CSN3和miRNA的內(nèi)參基因，引物設(shè)計見表2。擴增程序：95 ℃ 30 s，然后95 ℃ 5 s，40個循環(huán)，60 ℃ 34 s。采用2-ΔΔCt方法計算目的基因相對表達量。

表2 CSN3和miRNA的引物設(shè)計Table 2 Primer design for CSN3 and miRNA

1.10 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0軟件對牛奶中CSN3濃度、產(chǎn)奶量以及CSN3和miRNA基因相對表達量進行單因素方差分析；對2組之間相對熒光素酶活性進行t檢驗。數(shù)據(jù)顯示為平均值±標準誤，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。使用SigmaPlot 14.0軟件繪制圖形。

2 結(jié) 果

2.1 CSN3濃度

ELISA法測定不同泌乳階段奶牛分泌的牛奶中CSN3濃度(圖1)，在不同泌乳期，CSN3濃度差異不顯著(P>0.05)。然而，從產(chǎn)后60 d到產(chǎn)后240 d，奶牛產(chǎn)奶量顯著下降(P<0.05)(圖1)。3個泌乳階段平均產(chǎn)奶量分別為21.044、15.872、10.326 kg。因此，從產(chǎn)后60 d到產(chǎn)后240 d，牛奶中CSN3蛋白總量呈現(xiàn)降低趨勢(CSN3蛋白總量=CSN3濃度×產(chǎn)奶量)。

產(chǎn)奶量的數(shù)據(jù)顯示為5頭奶牛的平均值。檢測時間分別為產(chǎn)后60 d、產(chǎn)后120 d和產(chǎn)后240 d。The data of milk yield showed an average milk yield of five cows. The determined time was 60th day, 120th day and 240th day after delivery.圖1 牛奶中CSN3濃度和產(chǎn)奶量變化Fig.1 Changes in milk CSN3 concentration and milk yield

2.2 差異表達的miRNA

本試驗RNA的完整性指標RIN>7.0，樣品可以用于后續(xù)測序。測序原始數(shù)據(jù)已存入美國國家生物技術(shù)信息中心(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA589107)。本試驗比較了不同泌乳期構(gòu)建的3個miRNA文庫，通過卡方檢驗(P≤0.05)和倍數(shù)改變(|log2(倍數(shù)改變)|>1)篩選差異表達的miRNA。3個文庫中共檢測到1 949個miRNA，其中有390個差異表達。在差異表達的miRNA中，有11個低表達的miRNA被刪除。其中，中、高表達miRNA共379個，僅僅93個高表達的miRNA。不考慮miRNA前體和染色體位置的不同，只有77個miRNA呈現(xiàn)高表達，且在不同泌乳階段差異顯著(P<0.05)，見表3。

表3 奶牛乳腺組織3個泌乳階段均呈現(xiàn)高表達且差異顯著的miRNATable 3 Highly and differentially expressed miRNA in three lactation stages of cow mammary gland (n=77)

2.3 TargetScan預(yù)測

根據(jù)TargetScan預(yù)測，CSN3-3’UTR上有2個保守位點和21個保守性差的miRNA結(jié)合位點(表4)。

表4 TargetScan預(yù)測的靶向CSN3的miRNATable 4 Predicted miRNA targeting CSN3 with TargetScan

續(xù)表4保守位點Conserved sites非翻譯區(qū)中的位置Position in the UTR/bp保守性差的位點Poorly conserved sites非翻譯區(qū)中的位置Position in the UTR/bpbta-miR-193b74～80bta-miR-193a-3p74～80bta-miR-236497～103bta-miR-2317113～119bta-miR-2329-3p113～119bta-miR-2284j152～158bta-miR-2284n152～158bta-miR-2284c152～158bta-miR-2284ab152～158bta-miR-2284m152～158bta-miR-2284d152～158bta-miR-2284v152～158bta-miR-2284k152～158

2.4 交集

刪除低表達的miRNA后，只有4個中表達的miRNA保留在預(yù)測范圍內(nèi)(表5)。它們是bta-miR-33a、bta-miR-2284ab、bta-miR-193a-3p、bta-miR-193b。這4個miRNA與CSN3-3’UTR結(jié)合的最小自由能分別為-16.1、-18.6、-21.8和-20.9 kcal/mol(1 kcal/mol≈4.184 kJ/mol)(表6)。

表5 交集中4個miRNA的測序數(shù)據(jù)分析Table 5 Sequencing data analysis of four miRNA in intersection

表6 RNAhybrid預(yù)測miRNA與CSN3-3’UTR的結(jié)合情況Table 6 Prediction for miRNA binding CSN3-3’UTR with RNAhybrid

2.5 bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p靶向CSN3-3’UTR的雙熒光驗證

bta-miR-33a和bta-miR-2284ab模擬物(mimic)與陰性對照模擬物(mimic NC)相比，雙熒光素酶活性無顯著性差異(P>0.05)(圖2-a、圖2-b)。當bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p模擬物被轉(zhuǎn)染后，雙熒光素酶活性極顯著下降(P<0.01)(圖2-c、圖2-d)。與陰性對照模擬物相比，bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p模擬物導(dǎo)致螢火蟲熒光素酶/腎素酶的比值分別下降28%和26%。綜上所述，這些結(jié)果提示bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p可直接結(jié)合CSN3-3’UTR，從而調(diào)節(jié)CSN3的表達。

mimic NC：陰性對照模擬物 negative control mimic。P<0.01：差異極顯著 significant difference。圖2 4種miRNA相對熒光素酶活性的變化Fig.2 Change of relative luciferase activity for four miRNA

2.6 CSN3、bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p的變化趨勢

為了驗證CSN3與bta-miR-193家族之間的關(guān)系，對牛奶體細胞樣品中這些基因的相對表達量進行了檢測。牛奶體細胞CSN3的相對表達量從產(chǎn)后60 d到產(chǎn)后120 d極顯著下降(P<0.01)(圖3)。相反，bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p在產(chǎn)后60 d至產(chǎn)后120 d呈上升趨勢，且bta-miR-193b變化產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異(P<0.01)(圖3)。

P<0.01：差異極顯著 significant difference；P>0.05：差異不顯著 no significant difference。圖3 不同時期牛奶體細胞中3個基因(CSN3、bta-miR-193b、bta-miR-193a-3p)的相對表達趨勢Fig.3 Relative expression trends of three genes (CSN3, bta-miR-193b and bta-miR-193a-3p) in milk somatic cells at different stages

3 討 論

作為小的非編碼RNA分子，miRNA可以結(jié)合靶基因的3’UTR來抑制靶基因的表達[10]。每個miRNA可以調(diào)節(jié)上百個基因，每個基因可以受到上百個miRNA的調(diào)節(jié)[11]。牛奶中CSN3濃度在3個泌乳期間沒有明顯變化，但產(chǎn)奶量急劇下降，這意味著乳腺表達的CSN3的蛋白總量下降了。為了從miRNA角度探索CSN3表達的調(diào)控機制，采用TargetScan預(yù)測搜索靶向牛CSN3的miRNA。和其他預(yù)測工具一樣，TargetScan預(yù)測也選擇進化上保守的miRNA結(jié)合位點。假陽性是預(yù)測軟件中常見的問題。因此，本試驗將小RNA測序分析與軟件預(yù)測相結(jié)合。為了獲得盡可能多的候選miRNA，只放棄在3個階段沒有顯著差異或者低表達水平的miRNA。軟件預(yù)測范圍內(nèi)的大多數(shù)miRNA表達水平較低。通過這種方法，本試驗篩選到4個可能靶向CSN3的miRNA。

在這項研究中，使用基因的3’UTR來搜索miRNA，這比使用miRNA搜索靶基因在方法上更易操作。研究人員只需構(gòu)建一個CSN3-3’UTR的載體，逐個測試不同的miRNA。根據(jù)雙熒光素酶活性測定結(jié)果，只有bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p引起相對熒光素酶活性明顯下降。而bta-miR-33a和bta-miR-2284ab沒有這個功能，盡管依據(jù)軟件預(yù)測bta-miR-33a具有保守的結(jié)合位點。

最小自由能和小RNA測序在避免預(yù)測的假陽性方面具有積極作用。與CSN3-3’UTR結(jié)合時，bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p的最小自由能均低于bta-miR-33a和bta-miR-2284ab。自由能越低，結(jié)合的可能性就越高。與此同時，依據(jù)小RNA測序數(shù)據(jù)結(jié)果，bta-miR-193b的表達在3個泌乳階段持續(xù)增加。這種現(xiàn)象與miRNA對靶基因的負調(diào)節(jié)作用相吻合。依據(jù)測序數(shù)據(jù)中bta-miR-33a和bta-miR-2284ab的表達趨勢變化，可以將它們從預(yù)測的范圍內(nèi)剔除。同時，雙熒光素酶試驗結(jié)果證實了bta-miR-33a和bta-miR-2284ab不能靶向CSN3。

牛奶體細胞的基因表達數(shù)據(jù)為bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p靶向CSN3提供了進一步的依據(jù)。關(guān)于miR-193家族的資料不多，目前的研究主要集中于miR-193b抑制腫瘤和促進脂肪生成方面[12-13]，miR-193a也在很多腫瘤中表現(xiàn)為抑制作用[14]。這2個miRNA在牛上的報道很少，最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，bta-miR-193b通過靶向乙酰輔酶A合成酶2(ACSS2)來調(diào)節(jié)牛脂肪細胞的發(fā)育[15]；bta-miR-193a-3p在牛乳腺上皮細胞(MAC-T)中具有時間表達差異性[16]。但關(guān)于miR-193家族調(diào)控乳蛋白方面還未見任何報告。尋找調(diào)節(jié)乳蛋白的miRNA對于研究乳蛋白合成的調(diào)節(jié)機制至關(guān)重要。下一步試驗，本課題組將進行bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p靶向CSN3的細胞培養(yǎng)水平和活體動物水平驗證。

4 結(jié) 論

通過小RNA高通量測序、生物信息學(xué)預(yù)測、結(jié)合位點自由能分析、雙熒光結(jié)合分析、熒光定量分析，表明bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p靶向CSN3，但還需進行奶牛乳腺細胞試驗和活體動物試驗的進一步驗證。產(chǎn)后60 d至產(chǎn)后240 d，隨著產(chǎn)奶量的下降，我們推測bta-miR-193b和bta-miR-193a-3p在維持牛奶中CSN3濃度穩(wěn)定方面起關(guān)鍵作用。本試驗為后期開展miRNA調(diào)控CSN3以及牛奶中CSN3穩(wěn)定機制的研究指明了方向。