張幫柱，藺原，曾艷

攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院普外科，四川攀枝花617000

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(NENs)是一類起源于干細(xì)胞且具有神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物的、能夠產(chǎn)生生物活性胺和(或)多肽激素的腫瘤，胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(GEP-NENs)是其最常見的類型[1-2]。近年來，GEP-NENs的發(fā)病率迅速上升，其發(fā)病率在消化系統(tǒng)腫瘤中僅次于結(jié)腸癌[3]。目前，GEP-NENs發(fā)病的確切分子機(jī)制尚不完全清楚，手術(shù)切除仍然是其最主要的治療手段，但術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移概率較高，患者預(yù)后較差。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt、不具備蛋白編碼功能的RNA分子，但可在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等層面上調(diào)控基因的表達(dá)，從而參與調(diào)控多種生物學(xué)過程[4-5]。肝細(xì)胞核因子1α-反義鏈1(HNF1A-AS1)是近年發(fā)現(xiàn)的一種反義lncRNA。有研究報(bào)道，lncRNA HNF1A-AS1能夠參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，與胃癌、膠質(zhì)瘤、乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6-8]。但lncRNA HNF1A-AS1在GEP-NENs中的作用尚不明確。本研究觀察了GEP-NENs組織lncRNA HNF1A-AS1表達(dá)變化，并分析其表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年1月—2017年12月攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院收治的GEP-NENs患者85例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)檢查明確GEP-NENs診斷；②初診；③接受根治性或姑息性手術(shù)治療，術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療；④臨床病理資料和術(shù)后隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤者；②合并心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重功能不全者；③合并全身感染性疾病者；④合并造血系統(tǒng)疾病者。其中，男48例、女37例，年齡45～75(58.1±5.8)歲；腫瘤直徑：≥3 cm 64例，<3 cm 21例；腫瘤部位：胃腸道66例，胰腺19例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期37例，Ⅲ、Ⅳ期48例；浸潤深度：T1、T2期32例，T3、T4期53例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移56例。本研究經(jīng)攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批編號(hào)：2021NL-067-04)，患者或其家屬知情同意并簽屬知情同意書。

1.2 lncRNA HNF1A-AS1表達(dá)檢測 取手術(shù)切除的GEP-NENs組織及其配對(duì)的癌旁組織(距腫瘤組織邊緣≥5 cm，并經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)檢查證實(shí)為正常組織)，置于-80 ℃冰箱保存。取凍存組織200 mg，剪碎后置于EP管中，采用TRIzol法提取組織總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外可見分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA完整且濃度和純度合格。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。以cDNA為模板，按PCR試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：lncRNA HNF1A-AS1上游引物5′-TCAAGAAATGGTGGCTAT-3′，下游引物5′-GCTCTGAGACTGGCTGAA-3′；GAPDH上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′，下游引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR擴(kuò)增體系共20 μL：cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，SYBR Green Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s共40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后繪制熔解曲線，收集循環(huán)閾值(CT)數(shù)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算lncRNA HNF1A-AS1相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 隨訪 所有患者出院后通過門診或電話方式定期隨訪，隨訪截至2020年12月，統(tǒng)計(jì)患者生存情況，計(jì)算3年累積生存率。

2 結(jié)果

2.1 GEP-NENs組織與癌旁正常組織lncRNA HNF1A-AS1表達(dá)比較 GEP-NENs組織lncRNA HNF1A-AS1相對(duì)表達(dá)量為0.430±0.181，癌旁正常組織為0.792±0.202。GEP-NENs組織lncRNA HNF1A-AS1相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織(t=-12.294，P<0.01)。

2.2 GEP-NENs組織lncRNA HNF1A-AS1表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 GEP-NENs組織lncRNA HNF1A-AS1表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 lncRNA HNF1A-AS1表達(dá)與GEP-NENs患者預(yù)后的關(guān)系 截至2020年12月，共隨訪5～36(24.26±7.39)個(gè)月，死亡32例。以GEP-NENs組織lncRNA HNF1A-AS1相對(duì)表達(dá)量的均數(shù)為截?cái)嘀?，將GEP-NENs患者分為lncRNA HNF1A-AS1高表達(dá)者(≥0.430，41例)與lncRNA HNF1A-AS1低表達(dá)者(<0.430，44例)。隨訪期間，lncRNA HNF1A-AS1高表達(dá)者死亡10例，3年累積生存率為75.61%(31/41)；lncRNA HNF1A-AS1低表達(dá)者死亡22例，3年累積生存率為50.00%(22/44)。lncRNA HNF1A-AS1高表達(dá)者3年累積生存率明顯高于lncRNA HNF1A-AS1低表達(dá)者(χ2=10.667，P<0.01)。見圖1。

圖1 不同lncRNA HNF1A-AS1表達(dá)GEP-NENs患者的生存曲線

2.4 GEP-NENs患者預(yù)后的影響因素分析 單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析顯示，年齡、TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和lncRNA HNF1A-AS1表達(dá)可能與GEP-NENs患者預(yù)后不良有關(guān)(P均<0.05)。見表2。

表2 GEP-NENs患者預(yù)后不良的單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果

以GEP-NENs患者預(yù)后情況(死亡=1，存活=0)為因變量，以性別(男=1，女=0)、年齡(≥60歲=1，<60歲=0)、腫瘤直徑(≥3 cm=1、<3 cm=0)、腫瘤部位(胃腸道=1，胰腺=0)、TNM分期(Ⅲ、Ⅳ期=1，Ⅰ、Ⅱ期=0)、浸潤深度(T3、T4期=1，T1、T2期=0)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有=1，無=0)、lncRNA HNF1A-AS1表達(dá)(連續(xù)變量)為自變量，納入多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNM分期Ⅲ、Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是GEP-NENs患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，而lncRNA HNF1A-AS1高表達(dá)是其保護(hù)因素(P均<0.05)。見表3。

表3 GEP-NENs患者預(yù)后不良的多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果

3 討論

NENs是一類起源于神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的腫瘤。既往認(rèn)為，NENs是一種發(fā)病率低且相對(duì)罕見的腫瘤。但隨著對(duì)NENs研究不斷深入和檢查技術(shù)不斷提升，NENs的檢出率逐漸升高。GEP-NENs是NENs最常見的類型，占所有NENs的60%以上[1]。目前，GEP-NENs發(fā)病的確切分子機(jī)制尚不完全清楚，手術(shù)切除仍然是其最主要的治療手段。但由于GEP-NENs具有高度異質(zhì)性，同一患者可出現(xiàn)多個(gè)或多種NENs，術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移概率較高，預(yù)后較差[9]。

lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt、不具備蛋白編碼功能的RNA分子，可通過競爭性結(jié)合特定蛋白或miRNA，形成分子海綿效應(yīng)，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[10-11]。研究表明，人類腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為與腫瘤組織異常表達(dá)的lncRNA密切相關(guān)[4-5]。HNF1A-AS1是lncRNA家族成員之一，是一個(gè)長度為2 785個(gè)核苷酸的單外顯子轉(zhuǎn)錄本，定位于人染色體12q24.31。lncRNA HNF1A-AS1最早在食管腺癌的RNA測序分析中被發(fā)現(xiàn)，其在食管腺癌組織中高表達(dá)，并能夠促進(jìn)食管腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。LIU等[13]研究報(bào)道，在胃癌組織中l(wèi)ncRNA HNF1A-AS1表達(dá)上調(diào)，lncRNA HNF1A-AS1可通過結(jié)合miR-30b-3p激活PI3K-AKT信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移以及腫瘤血管生成等。GUO等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA HNF1A-AS1表達(dá)上調(diào)，lncRNA HNF1A-AS1可通過靶向miR-124調(diào)控肌球蛋白Ⅵ，促進(jìn)結(jié)腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移。但SHI等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中l(wèi)ncRNA HNF1A-AS1表達(dá)下調(diào)，并在體外研究中證實(shí)上調(diào)lncRNA HNF1A-AS1表達(dá)能夠抑制喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。以上研究表明，lncRNA HNF1A-AS1能夠參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。但lncRNA HNF1A-AS1在GEP-NENs中的作用尚不明確。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GEP-NENs組織lncRNA HNF1A-AS1相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織，并且lncRNA HNF1A-AS1表達(dá)與TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示lncRNA HNF1A-AS1表達(dá)降低與GEP-NENs惡性進(jìn)展有關(guān)，lncRNA HNF1A-AS1在GEP-NENs中可能發(fā)揮抑癌基因作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA HNF1A-AS1高表達(dá)者3年累積生存率明顯高于lncRNA HNF1A-AS1低表達(dá)者，提示lncRNA HNF1A-AS1表達(dá)降低可導(dǎo)致GEP-NENs患者預(yù)后不良，其原因與lncRNA HNF1A-AS1表達(dá)降低能夠促進(jìn)GEP-NENs惡性進(jìn)展有關(guān)。有研究將lncRNA HNF1A-AS1轉(zhuǎn)染至GEP-NENs細(xì)胞系LCC-18、BON-1，發(fā)現(xiàn)LCC-18細(xì)胞和BON-1細(xì)胞的增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力顯著降低，其機(jī)制可能與lncRNA HNF1A-AS1能夠靶向下調(diào)抑瘤素M表達(dá)有關(guān)[16-17]。魏亞玲[18]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA HNF1A-AS1和抑瘤素M為GEP-NENs組織中的差異表達(dá)基因，上調(diào)lncRNA HNF1A-AS1能夠抑制抑瘤素M表達(dá)，進(jìn)而抑制GEP-NENs細(xì)胞侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，即使在排除年齡、TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)GEP-NENs患者預(yù)后的影響，lncRNA HNF1A-AS1高表達(dá)仍然是GEP-NENs患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素，提示lncRNA HNF1A-AS1有可能成為評(píng)估GEP-NENs患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

綜上所述，GEP-NENs組織lncRNA HNF1A-AS1低表達(dá)，其表達(dá)變化與TNM分期、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；lncRNA HNF1A-AS1高表達(dá)是GEP-NENs患者預(yù)后的保護(hù)因素。但lncRNA HNF1A-AS1在GEP-NENs發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。