何至，顏端國(guó)，嚴(yán)林

1 監(jiān)利市人民醫(yī)院骨一科，湖北監(jiān)利433300；2 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院骨一科

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP)是發(fā)生于絕經(jīng)后婦女的一種常見(jiàn)代謝性疾病，由于雌激素缺乏導(dǎo)致骨量減少和骨組織結(jié)構(gòu)變化，骨脆性增加而易于發(fā)生骨折，是中老年婦女生活質(zhì)量降低以及致殘或致死的重要原因[1]。研究證實(shí)，表觀遺傳學(xué)參與PMOP的發(fā)生、發(fā)展。微小RNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度為20～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA。有研究報(bào)道，部分miRNA能夠通過(guò)調(diào)控破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化，參與PMOP的發(fā)生、發(fā)展[2]。miR-21是miRNA家族成員之一，定位于人染色體17q23.2。PERKSANUSAK等[3]研究發(fā)現(xiàn)，PMOP患者血清miR-21表達(dá)明顯降低，提示miR-21能夠參與PMOP的發(fā)生、發(fā)展。Smad同源物7(Smad7)是在成骨分化和骨形成過(guò)程中起重要作用的TGF-β信號(hào)通路的內(nèi)源性負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子。Smad7能夠抑制成骨細(xì)胞增殖和分化，從而影響骨形成和骨分化[4]。LI等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-21能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Smad7促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化。鄧純博等[6]研究報(bào)道，在通過(guò)雙側(cè)卵巢切除去勢(shì)建立的骨質(zhì)疏松癥(OP)小鼠模型骨組織中miR-21表達(dá)明顯降低，而Smad7表達(dá)明顯升高，提示miR-21、Smad7可能參與PMOP的發(fā)生、發(fā)展。但目前PMOP患者血清miR-21、Smad7表達(dá)變化及其與骨密度和骨代謝關(guān)系的研究相對(duì)較少。本研究探討了PMOP患者血清miR-21、Smad7表達(dá)變化及其臨床意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1月—2020年1月監(jiān)利市人民醫(yī)院收治的PMOP患者40例(骨質(zhì)疏松組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診治指南》中關(guān)于PMOP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②初診，入院前未接受任何抗骨質(zhì)疏松治療；③年齡50～75歲；④絕經(jīng)1年以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并自身免疫功能異常者；②存在肝腎功能不全者；③合并甲狀腺或甲狀旁腺疾病、糖尿病、垂體疾病等影響骨代謝疾病者；④合并心腦血管疾病者；⑤臨床資料不完整者。同期另選在監(jiān)利市人民醫(yī)院就診的，與骨質(zhì)疏松組臨床資料相匹配的絕經(jīng)后骨密度降低(-2.5 SD≤骨密度<-1.0 SD)患者40例(骨密度降低組)和絕經(jīng)后骨密度正常(-1.0 SD≤骨密度≤1.0 SD)健康志愿者40例(骨密度正常組)。其中，骨質(zhì)疏松組年齡(61.4±4.8)歲，BMI(21.56±4.68)kg/m2，有吸煙史21例，合并高血壓6例、高脂血癥4例；骨密度降低組年齡(60.3±5.2)歲，BMI(21.78±4.57)kg/m2，有吸煙史19例，合并高血壓5例、高脂血癥3例；骨密度正常組年齡(59.7±4.5)歲，BMI(23.17±4.43)kg/m2，有吸煙史22例，合并高血壓4例、高脂血癥5例。三組年齡、BMI、吸煙史、合并癥等具有可比性。本研究經(jīng)監(jiān)利市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批編號(hào)：20170106)，所有研究對(duì)象或其家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 血清miR-21、Smad7 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采集所有研究對(duì)象就診當(dāng)日清晨空腹肘靜脈血5 mL，置于含EDTA的真空采血管中，4 ℃下3 000 r/min離心10 min(離心半徑13.5 cm)，留取上層血清，-80 ℃冰箱保存。采用TRIzol法提取血清總RNA，經(jīng)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格。按PrimeScriptTMRT Reagent Kit說(shuō)明，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以cDNA為模板，按SYBR?Premix EX TaqTMⅡ說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：miR-21上游引物5′-GCGGTAGCTTATCAGACTGA-3′、下游引物5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′，內(nèi)參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；Smad7上游引物5′-TGTCCAGATGCTGTGCCTTCCT-3′、下游引物5′-CTCGTCTTCTCCTCCCAGTATG-3′，內(nèi)參GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′、下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。PCR反應(yīng)體系共25 μL：cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，2×SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL，dH2O 8.5 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后繪制熔解曲線，收集循環(huán)閾值(CT)數(shù)。以U6或GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 血清β-膠原降解產(chǎn)物(β-CTX)、1型前膠原氨基端延長(zhǎng)肽(P1NP)檢測(cè) 采集所有研究對(duì)象就診當(dāng)日清晨空腹肘靜脈血5 mL，置于含EDTA的真空采血管中，4 ℃下3 000 r/min離心10 min(離心半徑13.5 cm)，留取上層血清，-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法檢測(cè)血清β-CTX、P1NP。試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.4 骨密度檢測(cè) 所有研究對(duì)象就診當(dāng)日由專業(yè)技術(shù)人員使用雙能X射線骨密度儀檢測(cè)股骨、腰椎骨密度。

2 結(jié)果

2.1 三組血清miR-21、Smad7 mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表1。

表1 三組血清miR-21、Smad7 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 三組血清β-CTX、P1NP水平和股骨、腰椎骨密度比較 見(jiàn)表2。

表2 三組血清β-CTX、P1NP水平和股骨、腰椎骨密度比較

2.3 PMOP患者血清miR-21、Smad7 mRNA表達(dá)與血清β-CTX、P1NP水平及股骨、腰椎骨密度的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析顯示，PMOP患者血清miR-21表達(dá)與血清β-CTX、P1NP水平均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r分別為-0.667、-0.562，P均<0.05)，與股骨、腰椎骨密度均呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.549、0.538，P均<0.05)；血清Smad7 mRNA表達(dá)與血清β-CTX、P1NP水平均呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.710、0.535，P均<0.05)，與股骨、腰椎骨密度均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r分別為-0.604、-0.555，P均<0.05)；PMOP患者血清miR-21表達(dá)與Smad7 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.525，P<0.05)。

2.4 血清miR-21、Smad7 mRNA表達(dá)對(duì)PMOP的診斷效能分析 ROC曲線分析顯示，血清miR-21表達(dá)診斷PMOP的曲線下面積(AUC)為0.945(95%CI：0.910～0.981)，其cut off值為0.585，此時(shí)其診斷PMOP的靈敏度為80.0%、特異度為95.0%；血清Smad7 mRNA表達(dá)診斷PMOP的AUC為0.927(95%CI：0.877～0.977)，其cut off值為1.905，此時(shí)其診斷PMOP的靈敏度為78.8%、特異度為92.3%；二者聯(lián)合診斷PMOP的AUC為0.978(95%CI：0.950～1.000)，其診斷PMOP的靈敏度為99.8%、特異度為92.7%。

3 討論

OP是一種以骨量降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨質(zhì)脆性增加和易于骨折為特征的全身代謝性骨病。絕經(jīng)后婦女是OP的高發(fā)人群，其患病率超過(guò)50%，骨折率達(dá)到10%[8]。絕經(jīng)后婦女卵巢功能衰退，體內(nèi)雌激素水平下降，導(dǎo)致破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的代謝失衡，骨吸收亢進(jìn)，表現(xiàn)為骨密度下降，骨脆性增加，極易發(fā)生骨折[9-10]。隨著人口老齡化加劇，PMOP越來(lái)越受到重視。骨代謝包括骨形成和骨吸收兩個(gè)生化過(guò)程。隨著對(duì)骨代謝研究的不斷深入，骨形成標(biāo)志物和骨吸收標(biāo)志物已成為診治代謝性骨病的特異性指標(biāo)。β-CTX是細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原纖維降解產(chǎn)物，能夠反映骨基質(zhì)降解速率，而P1NP則能夠反映Ⅰ型膠原合成速度和成骨細(xì)胞活性，二者均與骨代謝、骨密度密切相關(guān)。雖然近年來(lái)骨代謝標(biāo)志物在診斷PMOP方面取得了一定進(jìn)展，但因其易受其他因素干擾，特異度較低，在PMOP早期診斷中的價(jià)值不能令人滿意[11]。

miRNA是一種廣泛存在的調(diào)控基因表達(dá)的小分子RNA。有研究報(bào)道，部分miRNA能夠通過(guò)調(diào)控破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化參與PMOP的發(fā)生、發(fā)展[2]。miR-21定位于人染色體17q23.2，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育及代謝等方面具有重要作用[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-21與成骨細(xì)胞分化和礦化有關(guān)[5]。Smad7是TGF-β信號(hào)通路的內(nèi)源性負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，能夠參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等一系列生物學(xué)活動(dòng)[14-16]。有研究報(bào)道，PMOP患者血清miR-21表達(dá)明顯降低；在雙側(cè)卵巢切除去勢(shì)建立的骨質(zhì)疏松癥小鼠模型骨組織中miR-21表達(dá)明顯降低，而Smad7表達(dá)明顯升高[3，6]。提示miR-21和Smad7可能是參與PMOP發(fā)生、發(fā)展的重要因子。β-CTX、P1NP是反映骨代謝的特異性標(biāo)志物，二者水平升高往往意味著骨轉(zhuǎn)換速率加快，即骨量丟失增加、骨密度降低[17]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松組血清miR-21表達(dá)明顯低于骨密度降低組和骨密度正常組,血清Smad7 mRNA表達(dá)和血清β-CTX、P1NP水平均明顯高于骨密度降低組和骨密度正常組；并且骨密度降低組血清miR-21表達(dá)明顯低于骨密度正常組，血清Smad7 mRNA表達(dá)和血清β-CTX、P1NP水平均明顯高于骨密度正常組。提示miR-21、Smad7可能參與PMOP的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。有研究報(bào)道，miR-21能夠介導(dǎo)Smad7下調(diào)來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[18]。本研究Pearson相關(guān)分析顯示，PMOP患者血清miR-21表達(dá)與股骨、腰椎骨密度均呈正相關(guān)關(guān)系，與血清β-CTX、P1NP水平均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；血清Smad7 mRNA表達(dá)與股骨、腰椎骨密度均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與血清β-CTX、P1NP水平均呈正相關(guān)關(guān)系；PMOP患者血清miR-21表達(dá)與Smad7 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。提示miR-21與Smad7可能共同參與PMOP的發(fā)生、發(fā)展。

本研究ROC曲線分析顯示，血清miR-21、Smad7 mRNA表達(dá)對(duì)PMOP均具有一定診斷價(jià)值，二者聯(lián)合時(shí)診斷價(jià)值更高。提示血清miR-21、Smad7可作為早期診斷PMOP的生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，PMOP患者血清miR-21表達(dá)降低、Smad7表達(dá)升高，二者可能共同參與PMOP的發(fā)生、發(fā)展；血清miR-21、Smad7表達(dá)對(duì)PMOP均具有較高的診斷價(jià)值，二者聯(lián)合時(shí)診斷價(jià)值更高。