趙偉，張杰

1 北京華信醫(yī)院(清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院)急診科，北京100016；2 北京市平谷區(qū)醫(yī)院急診科

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種常見的慢性關(guān)節(jié)疾病，多發(fā)生于中老年人群[1-2]。OA的主要臨床表現(xiàn)為慢性疼痛、關(guān)節(jié)變形和活動受限，病理特征包括關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞或喪失，軟骨下骨硬化或囊性變，關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成[3]。目前，OA的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[4]。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是指在基因組水平上由單個核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性。有研究報道，SNP與高血壓、阿爾茨海默病以及OA的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5-7]。CC趨化因子受體5(CCR5)是一種G蛋白偶聯(lián)受體，具有刺激血管生成、調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞募集以及誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸等作用。MAGNANI等[8]研究報道，攜帶CCR5基因Δ32純合突變體(Δ32/Δ32)人群前列腺癌的患病風(fēng)險低于野生型和雜合突變型。近年有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，CCR5基因SNP與炎癥相關(guān)性疾病密切相關(guān)[9]，而OA是一種慢性無菌性炎癥性疾病，由此推測CCR5基因SNP可能參與OA的發(fā)生、發(fā)展。但目前CCR5基因SNP與膝關(guān)節(jié)OA的關(guān)系鮮見報道。本研究探討了CCR5基因Δ32(rs333)、59029 A/G(rs1799987)位點SNP與膝關(guān)節(jié)OA易感性的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年5月—2018年12月在北京華信醫(yī)院就診的原發(fā)性膝關(guān)節(jié)OA患者380例(觀察組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合原發(fā)性膝關(guān)節(jié)OA臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；②Kellgren-Lawrence(K-L)分級≥Ⅱ級。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有關(guān)節(jié)外傷或手術(shù)史者；②合并類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)結(jié)核者；③合并心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重疾病者。其中，男232例、女148例，年齡(58.10±5.40)歲，BMI(24.16±2.44)kg/m2，有吸煙史106例，有飲酒史78例。同期隨機(jī)選擇在北京華信醫(yī)院體檢健康的志愿者380例(對照組)，男215例、女165例，年齡(56.41±4.39)歲，BMI(23.75±1.98)kg/m2，有吸煙史115例，有飲酒史90例。兩組基本資料具有可比性。本研究經(jīng)北京華信醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：HXYY_201500114)，所有研究對象或其家屬知情同意并簽屬書面知情同意書，研究設(shè)計和實施過程符合《赫爾辛基宣言》。

1.2 CCR5基因SNP檢測

1.2.1 全血基因組DNA提取 采集所有研究對象清晨空腹肘靜脈血5 mL，EDTA-2K抗凝，-80 ℃超低溫冰箱保存。按照人全血基因組DNA提取試劑盒說明提取基因組DNA，經(jīng)NanoDrop 2000C超微量分光光度計鑒定，提取的基因組DNA合格，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 高保真PCR擴(kuò)增 按照Phusion?超保真PCR Master Mix說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。引物序列：Δ32位點上游引物5′-GCTGTCGTCCATGCTGTGTTT-3′、下游引物5′-CAACCTGTTAGAGCTACTGCAATT-3′，59029 A/G位點上游引物5′-CCCGTGAGCCCATAGTTAAAACTC-3′、下游引物5′-TCACAGGGCTTTTCAACAGTAAGG-3′。PCR擴(kuò)增體系共50 μL：DNA模板1 μL，上下游引物各1.5 μL，PCR Master Mix 25 μL，滅菌水21 μL；反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min，然后98 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s共36個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束，取PCR產(chǎn)物4 μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳(140 V 15 min)，紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

1.2.3 Sanger-DNA測序 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測序。產(chǎn)物經(jīng)純化后，加入10 μL Hi-Di Formamida充分溶解，95 ℃變性5 min后迅速置于冰水中冷卻4 min，變性產(chǎn)物置于3500dx測序儀分析。根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始，隨機(jī)在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進(jìn)行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳，從而獲得可見的DNA堿基序列，最后經(jīng)Chromas軟件(v2.6.5)分析。

2 結(jié)果

2.1 CCR5基因Δ32、59029 A/G位點基因型分析 CCR5基因Δ32位點PCR產(chǎn)物長度為441 bp，59029 A/G位點PCR產(chǎn)物長度為268 bp，見圖1A。CCR5基因Δ32位點存在3種基因型，分別為Wt/Wt、Wt/Δ32、Δ32/Δ32，見圖1B；CCR5基因59029 A/G位點存在3種基因型，分別為AA、AG、GG，見圖1C。

注：A為PCR跑膠結(jié)果，B為CCR5基因Δ32位點基因型測序結(jié)果，C為CCR5基因59029 A/G位點基因型測序結(jié)果。

2.2 兩組CCR5基因Δ32位點基因型和等位基因分布比較 兩組CCR5基因Δ32位點基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，具有群體代表性。兩組CCR5基因Δ32位點Wt/Wt、Wt/Δ32、Δ32/Δ32基因型分布以及Wt、Δ32等位基因分布比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 兩組CCR5基因Δ32位點基因型和等位基因分布比較

2.3 兩組CCR5基因59029 A/G位點基因型和等位基因分布比較 兩組CCR5基因59029 A/G位點基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，具有群體代表性。兩組CCR5基因59029 A/G位點AA、GG基因型分布以及A、G等位基因分布比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，而AG基因型分布比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組CCR5基因59029 A/G位點基因型和等位基因分布比較

2.4 兩組CCR5基因單體型分析 兩組CCR5基因Wt-A、Wt-G、Δ32-A單體型頻率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，而兩組CCR5基因Δ32-G單體型頻率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組CCR5基因單體型頻率比較[頻數(shù)(%)]

3 討論

近年來，隨著我國人口老齡化加劇和生活方式轉(zhuǎn)變，膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)病率不斷上升，已成為導(dǎo)致我國60歲以上男性喪失勞動能力的主要原因之一。但目前膝關(guān)節(jié)OA的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，仍需進(jìn)一步探索，以期為膝關(guān)節(jié)OA的防治提供依據(jù)。

SNP是人類基因組DNA中最常見、最穩(wěn)定的基因變異。近年來，越來越多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)某些基因SNP與OA的易感性密切相關(guān)[10]。例如，YANG等[11]研究發(fā)現(xiàn)，SMAD家族成員3基因rs12901499位點多態(tài)性能夠增加OA的發(fā)病風(fēng)險；ZHANG等[12]研究報道，mutY DNA糖基化酶基因rs3219463位點G等位基因攜帶者和ORAI鈣釋放活化鈣調(diào)節(jié)劑1基因rs7135617位點T等位基因攜帶者OA的發(fā)病風(fēng)險明顯升高；CEKIN等[13]研究認(rèn)為，叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子3基因rs3761548位點多態(tài)性與土耳其人OA的發(fā)病風(fēng)險增加有關(guān)。此外，TANG等[14]通過薈萃分析發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體10基因多態(tài)性與髖關(guān)節(jié)OA的易感性密切相關(guān)。以上研究結(jié)果表明，某些基因SNP在OA的發(fā)病過程中可能扮演重要角色。

CCR5是一種G蛋白偶聯(lián)受體，作為趨化因子受體，能夠調(diào)節(jié)記憶或效應(yīng)T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、未成熟樹突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的運(yùn)輸和效應(yīng)功能[15]。CCR5基因能夠與趨化因子配體3(CCL3)、CCL4和CCL5結(jié)合，通過G蛋白偶聯(lián)發(fā)揮作用。既往研究證實，CCR5通過PKCδ/c-Src/c-Jun和AP-1信號通路增加人OA滑膜成纖維細(xì)胞中IL-6產(chǎn)生，加劇疾病進(jìn)展[16]。Δ32位點(chr3：46373453-46373487)位于CCR5基因開放閱讀框，59029 A/G位點(chr3：46370444)位于CCR5基因啟動子區(qū)域，這兩個位點是CCR5基因最常見的SNP。有研究發(fā)現(xiàn)，CCR5基因Δ32位點SNP與自身免疫性疾病和神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)[17-18]。SMOLEN-DZIRBA等[19]研究報道，CCR5基因Δ32位點Δ32/Δ32基因型可能在HIV-1感染中具有保護(hù)作用，尤其對于未感染HIV-1人群。MATOS等[20]研究認(rèn)為，CCR5基因Δ32位點SNP與巴西甲型H1N1流感的嚴(yán)重程度和病死率有一定關(guān)系。DROZD-DABROWSKA等[21]研究發(fā)現(xiàn)，CCR5基因Δ32位點SNP具有抵抗HBV感染及加速HBV感染恢復(fù)的能力。最近，KESHAVARZI等[22]研究發(fā)現(xiàn)，CCR5基因59029 A/G位點AA基因型與2型糖尿病的發(fā)病密切相關(guān)，而AG、GG基因型與2型糖尿病的發(fā)病無關(guān)。這些研究結(jié)果表明，CCR5基因SNP與炎癥相關(guān)性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。而OA是一種慢性無菌性炎癥性疾病，由此推測CCR5基因SNP可能參與OA的發(fā)生、發(fā)展。但目前CCR5基因SNP與膝關(guān)節(jié)OA的關(guān)系鮮見報道。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組CCR5基因Δ32位點Wt/Wt、Wt/Δ32、Δ32/Δ32基因型分布以及Wt、Δ32等位基因分布與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示CCR5基因Δ32位點SNP與膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)生無關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組CCR5基因59029 A/G位點AA、GG基因型分布以及A、G等位基因分布與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，提示CCR5基因59029 A/G位點SNP與膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)生有關(guān)。單體型是個體組織中完全遺傳自父母雙方中一個親本的一組等位基因，又叫單倍體型或單元型。基于單體型的分析方法在OA的研究中越來越受到重視。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組CCR5基因Δ32-G單體型頻率與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而CCR5基因Wt-A、Wt-G、Δ32-A單體型頻率與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示CCR5基因Δ32-G單體型與膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)生有關(guān)。

綜上所述，CCR5基因Δ32位點SNP與膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)生無關(guān)，而59029 A/G位點SNP與膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)生有關(guān)，攜帶GG基因型或Δ32-G單體型者膝關(guān)節(jié)OA的發(fā)生風(fēng)險明顯增加。但由于本研究樣本量有限，其結(jié)論仍需多中心、大樣本量進(jìn)一步驗證。