孫紹偉，張煥虎，曹金，宮慶，韓傳吉

山東大學(xué)附屬威海市立醫(yī)院胃腸外科，山東威海264200

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，在我國其發(fā)病率和病死率分別居惡性腫瘤的第3位和第5位[1-2]。手術(shù)切除仍然是目前結(jié)直腸癌最主要的治療手段，但術(shù)后轉(zhuǎn)移的風(fēng)險較高。據(jù)報道，50%～60%結(jié)直腸癌患者術(shù)后發(fā)生肝轉(zhuǎn)移[3]。因此，早期發(fā)現(xiàn)并控制結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移就顯得尤為重要。近年研究證實，DNA甲基化與腫瘤惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[4]。與基因突變不同，DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)催化完成的一種表觀遺傳學(xué)修飾，在促癌基因或抑癌基因的表達(dá)調(diào)控中具有至關(guān)重要的作用[5]。因此，DNMT被認(rèn)為是惡性腫瘤的一個潛在治療靶標(biāo)。VERLAAT等[6]研究發(fā)現(xiàn)，DNMT抑制劑在維持腫瘤細(xì)胞中DNA甲基化沉默的腫瘤抑制基因重新表達(dá)方面具有明顯效果。5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-AzaDc)，中文名為地西他濱，是一種新型DNMT抑制劑。5-AzaDc能夠在DNA復(fù)制過程中替代胞嘧啶，競爭性結(jié)合DNMT，抑制DNMT活性，從而達(dá)到抑制DNA甲基化的作用。目前，5-AzaDc主要作為惡性血液病的治療藥物，用于治療結(jié)直腸癌的報道較少，對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的治療更是鮮有報道。2020年1月—3月，本研究構(gòu)建了裸鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，觀察了DNMT抑制劑5-AzaDc對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性BALB/c裸鼠50只，SPF級，6～8周齡，體質(zhì)量180～240 g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(湘)2019-0015。所有裸鼠于屏障系統(tǒng)動物房內(nèi)獨立通風(fēng)籠具中單籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(25±3)℃，相對濕度55%～60%，光照12 h明暗交替。實驗設(shè)計和實施過程符合動物福利和倫理要求。人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116(以下稱HCT116細(xì)胞)，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。DNMT抑制劑5-AzaDc，純度≥97%，購自美國Sigma-Aldrich公司。酶標(biāo)儀，購自上海昂拉儀器有限公司；Accuri C6 Plus流式細(xì)胞儀，購自北京賽百奧科技有限公司。DNMT活性檢測試劑盒，購自美國Epigentek公司。

1.2 動物分組處理 所有裸鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按隨機數(shù)字表法隨機分為模型組、對照組以及5-AzaDc低、中、高劑量組，每組10只。模型組和5-AzaDc低、中、高劑量組通過脾臟種植法構(gòu)建結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。具體方法：將HCT116細(xì)胞接種于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以獲取足夠數(shù)量的HCT116細(xì)胞；裸鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒，選擇左背部斜切口進腹暴露脾臟，將HCT116細(xì)胞緩慢注入脾臟，待脾臟被膜腫脹、變白后，壓迫止血并殺滅可能外滲的HCT116細(xì)胞，然后將脾臟放回原位，關(guān)腹。對照組予戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，選擇左背部斜切口進腹暴露脾臟，但不注入HCT116細(xì)胞，隨即關(guān)腹。麻醉清醒后，常規(guī)飼養(yǎng)，當(dāng)裸鼠出現(xiàn)明顯消瘦、行動遲緩、弓背、精神萎靡等現(xiàn)象時，5-AzaDc低、中、高劑量組分別腹腔注射1.0 μmol/L 5-AzaDc 0.3、0.4、0.5 mg/kg，每周1次，連續(xù)注射8周。對照組和模型組腹腔注射等量生理鹽水，每周1次，連續(xù)注射8周。

1.3 觀察指標(biāo) 各組腹腔注射8周后，采集外周靜脈血2 mL保存?zhèn)溆?，然后頸椎脫臼處死，無菌條件下剖腹取肝轉(zhuǎn)移瘤組織，PBS沖洗干凈，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 DNMT活性 取部分肝轉(zhuǎn)移瘤組織，剪碎、消化、再培養(yǎng)后，經(jīng)流式細(xì)胞儀分離，獲取肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞。按DNMT活性檢測試劑盒說明檢測DNMT活性。

1.3.2 腫瘤球數(shù)量 取部分肝轉(zhuǎn)移瘤組織，剪碎、消化、再培養(yǎng)后，經(jīng)流式細(xì)胞儀分離，獲取肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞。將肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞以500個/孔密度接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。從培養(yǎng)第3天開始，隔天于顯微鏡下觀察腫瘤球形成情況。培養(yǎng)2周時，顯微鏡下拍照，計數(shù)直徑>40 μm的腫瘤球數(shù)量。

1.3.3 細(xì)胞存活率 取部分肝轉(zhuǎn)移瘤組織，剪碎、消化、再培養(yǎng)后，經(jīng)流式細(xì)胞儀分離，獲取肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞。取肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞1×106個，PBS洗滌后，用結(jié)合緩沖液稀釋成密度為4×105個/mL細(xì)胞懸液，室溫下避光孵育10 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.4 血清CD44v6、VEGF檢測 取大鼠外周靜脈血，3 000 r/min離心10 mim、離心半徑8 cm，留取上層血清。采用ELISA法檢測血清CD44v6、VEGF。試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司，所有操作嚴(yán)格按試劑盒說明進行。

2 結(jié)果

2.1 各組肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞DNMT活性比較 對照組僅開腹，脾臟未注入HCT116細(xì)胞，無肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞形成。模型組與5-AzaDc低、中、高劑量組肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞DNMT活性分別為13.24±1.01、9.22±2.22、5.12±1.03、4.34±1.24。隨著5-AzaDc濃度升高，各組肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞DNMT活性逐漸降低(F=39.495，P<0.05)。5-AzaDc低、中、高劑量組肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞DNMT活性均低于模型組(P均<0.05)，5-AzaDc中、高劑量組肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞DNMT活性低于5-AzaDc低劑量組(P均<0.05)，而5-AzaDc中劑量組與5-AzaDc低劑量組肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞DNMT活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞腫瘤球數(shù)量和細(xì)胞存活率比較 對照組僅開腹，脾臟未注入HCT116細(xì)胞，無肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞形成。模型組與5-AzaDc低、中、高劑量組肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞腫瘤球數(shù)量和細(xì)胞存活率比較見表1。

表1 模型組與5-AzaDc低、中、高劑量組肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞腫瘤球數(shù)量和細(xì)胞存活率比較

2.3 各組血清CD44v6、VEGF水平比較 見表2。

表2 各組血清CD44v6、VEGF水平比較

3 討論

肝臟是結(jié)直腸癌血行轉(zhuǎn)移最主要的靶器官，臨床上10%～25%結(jié)直腸癌患者一經(jīng)確診便已發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，另有20%～25%結(jié)直腸癌患者在接受根治性手術(shù)后3年內(nèi)出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移[7-8]。肝轉(zhuǎn)移是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的重要因素，亦是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，據(jù)報道約30%結(jié)直腸癌患者死于肝轉(zhuǎn)移[9-10]。目前，臨床治療結(jié)直腸癌主要采取手術(shù)聯(lián)合放化療，但遠(yuǎn)期效果不佳，肝轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致治療失敗的重要原因[11-12]。因此，探索一種治療結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的有效手段，對改善患者預(yù)后具有重要意義。

近年來，隨著表觀遺傳學(xué)研究不斷深入，啟動子區(qū)高甲基化引起的多種抑癌基因失活被認(rèn)為可能是惡性腫瘤發(fā)生的重要原因。DNA甲基化是由DNMT催化下，以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將活性甲基轉(zhuǎn)移至DNA鏈中特定堿基上的化學(xué)修飾過程。作為一種表觀遺傳學(xué)修飾，DNA甲基化可在不改變DNA序列的前提下，對個體生長、發(fā)育以及基因表達(dá)等發(fā)揮重要的調(diào)控作用，并且這種修飾在細(xì)胞增殖過程中可穩(wěn)定傳遞。因此，DNA甲基化對腫瘤細(xì)胞的干性調(diào)控以及維持過程具有至關(guān)重要的作用[13-15]。5-AzaDc是一種新型DNMT抑制劑，可在DNA復(fù)制過程中替代胞嘧啶，競爭性結(jié)合DNMT，抑制DNMT活性，從而干擾DNMT對基因表達(dá)的調(diào)控作用。以往5-AzaDc主要用于治療惡性血液病，用于治療結(jié)直腸癌的報道較少，對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的治療更是鮮有報道。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組與5-AzaDc低、中、高劑量組肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞DNMT活性逐漸降低；5-AzaDc低、中、高劑量組肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞DNMT活性均低于模型組,并且5-AzaDc中、高劑量組肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞DNMT活性低于5-AzaDc低劑量組，而5-AzaDc中劑量組與5-AzaDc高劑量組肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞DNMT活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示5-AzaDc能夠抑制結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞DNMT活性，并且隨著5-AzaDc劑量增加，其作用效果越來越明顯。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，模型組與5-AzaDc低、中、高劑量組腫瘤球數(shù)量和細(xì)胞存活率均逐漸降低；5-AzaDc低、中、高劑量組腫瘤球數(shù)量和細(xì)胞存活率均低于模型組，并且5-AzaDc中、高劑量組腫瘤球數(shù)量和細(xì)胞存活率均低于5-AzaDc低劑量組，而5-AzaDc中劑量組腫瘤球數(shù)量和細(xì)胞存活率與5-AzaDc高劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果提示，5-AzaDc能夠抑制肝轉(zhuǎn)移廇細(xì)胞成瘤能力和侵襲能力。DNMT能夠通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路抑制SFTP1基因甲基化，在結(jié)直腸癌干細(xì)胞干性維持中具有至關(guān)重要的作用。而5-AzaDc通過抑制DNMT活性調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，促使SFTP1基因去甲基化，進而抑制結(jié)直腸癌干細(xì)胞干性以及肝轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞增殖和侵襲。此外，5-AzaDc作為新型DNMT抑制劑，能夠通過共價鍵與DNMT結(jié)合并形成不可逆的復(fù)合物，從而導(dǎo)致DNMT活性受到抑制，促使基因組甲基化水平降低，重新激活因高甲基化而失活的重要抑癌基因，最終發(fā)揮抗腫瘤作用。

CD44是一種分布極為廣泛的細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，CD44v6是其家族的重要成員。CD44v6過表達(dá)多見于轉(zhuǎn)移力強的腫瘤細(xì)胞。CD44v6能夠通過介導(dǎo)淋巴細(xì)胞歸巢以及改變腫瘤細(xì)胞骨架構(gòu)象和分布，影響腫瘤細(xì)胞的運動能力，使腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移潛能，從而形成轉(zhuǎn)移瘤并穩(wěn)固寄宿和生長。CD44v6因與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切而受到廣泛關(guān)注。在結(jié)直腸癌患者中，CD44v6高表達(dá)通常與肝轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。VEGF是新生血管形成的關(guān)鍵性調(diào)控因子，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。血清VEGF水平升高可促進新生血管形成，增加腫瘤轉(zhuǎn)移概率；血清VEGF水平升高還能增加血管通透性，使血漿蛋白外滲，從而為血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移提供基質(zhì)[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組和5-AzaDc低、中、高劑量組血清CD44v6、VEGF水平均高于對照組；5-AzaDc低、中、高劑量組血清CD44v6、VEGF水平均低于模型組，并且5-AzaDc中、高劑量組血清CD44v6、VEGF水平均低于5-AzaDc低劑量組，而5-AzaDc中劑量組血清CD44v6、VEGF水平與5-AzaDc高劑量組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。提示5-AzaDc能夠抑制結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移裸鼠血清CD44v6、VEGF水平，進而阻止腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。5-AzaDc可能通過抑制DNMT活性進而影響CD44v6、VEGF基因啟動子區(qū)域中CpG島甲基化，從而使血清CD44v6、VEGF水平降低。

綜上所述，5-AzaDc對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移具有一定抑制作用，其作用機制可能與抑制腫瘤血管形成有關(guān)。但目前5-AzaDc抑制結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的具體作用機制仍不完全清楚，尚需進一步研究。