陳紅英，高貴峰，閆少茹，王春艷，王長友

1 唐山市中醫(yī)醫(yī)院普外科，河北唐山060300；2 唐山市人民醫(yī)院骨科；3 華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院普外科

肝癌是全球常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。我國是肝癌的高發(fā)國家之一，盡管近年來人口標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率和病死率得到顯著改善，但肝癌的疾病負(fù)擔(dān)仍然較重[1]。目前，肝癌的治療方式包括手術(shù)、放化療、靶向治療等，但中晚期肝癌即使經(jīng)積極治療，5年生存率仍不足20%[2-3]。迄今為止，肝癌發(fā)病的確切分子機(jī)制仍不完全清楚。因此，深入探索肝癌發(fā)病的分子機(jī)制，對尋找肝癌精準(zhǔn)治療的新靶點具有重要意義。微小RNA(miRNA)是一類長度為19～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA分子。miRNA不僅能參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及胚胎發(fā)育等正常生物學(xué)過程，其表達(dá)失衡還能參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]。miR-191是一個由22個堿基組成的非編碼RNA，定位于人染色體3p21.31。有研究報道，miR-191可通過抑制表皮生長因子受體(EGFR)信號通路抑制細(xì)胞增殖；而在乳腺癌[5]、惡性腦膜瘤[6]等組織中miR-191表達(dá)下調(diào)，引起EGFR信號通路過度激活，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為。特異AT序列結(jié)合蛋白1(SATB1)是一種組織特異性的核基質(zhì)附著區(qū)結(jié)合蛋白，它能以獨特的模式識別并結(jié)合于基質(zhì)附著區(qū)，從而參與染色質(zhì)重塑、組蛋白乙酰化和甲基化等修飾過程[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，在食管鱗癌[8]、結(jié)直腸癌[9]等組織中SATB1過表達(dá)，并且其過表達(dá)能夠激活血小板源性生長因子受體，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。近年研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-191表達(dá)可導(dǎo)致SATB1表達(dá)上調(diào)，從而激活Wnt信號通路，繼而引起腫瘤惡性進(jìn)展[10]。但目前在肝癌中miR-191與SATB1的調(diào)控關(guān)系尚不清楚。2020年4月—2021年6月，本研究探討了miR-191靶向調(diào)控SATB1對肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞系HepG2、正常肝細(xì)胞系L02(以下分別稱HepG2、L02細(xì)胞)，購自美國模式菌種收集中心。引物序列、SATB1過表達(dá)質(zhì)粒及其陰性對照質(zhì)粒、miR-191 mimic，均由北京華大集團(tuán)設(shè)計合成。7500型實時熒光定量PCR儀，購自美國ABI公司；SpectraMax L化學(xué)發(fā)光型酶標(biāo)儀，購自美國Molecular Devices公司；NanoDrop 1000超微量分光光度計，購自美國Thermo Fisher Scientific公司。Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、SATB1、Cyclin D1、p27、GAPDH單克隆抗體以及相應(yīng)的二抗，購自英國Abcam公司。MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒，購自美國Promega公司；Transwell小室，購自美國Corning公司；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，購自美國ABI公司；Lipofectamine2000瞬時轉(zhuǎn)染試劑，購自美國Invitrogen公司；Nano-Glo?Dual-Luciferase Reporter (NanoDLRTM) Assay，購自美國Promega公司。

1.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 將HepG2、L02細(xì)胞接種于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶4傳代。取傳4代、對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3 miR-191、SATB1表達(dá)檢測 ①miR-191、SATB1 mRNA表達(dá)：采用RT-PCR技術(shù)。取HepG2、L02細(xì)胞各1×105個，按RNeasy Plus提取試劑盒說明提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)NanoDrop 1000超微量分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續(xù)實驗。然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。以cDNA為模板，按SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：miR-191上游引物5′-CAACGGAATCCCAAAAGCAGCTG-3′、下游引物5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCT-3′，內(nèi)參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物3′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-5′；SATB1上游引物5′-GATCATTTGAACGAGGCAACTCA-3′、下游引物5′-TGGACCCTTCGGATCACTCA-3′，內(nèi)參GAPDH上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′、下游引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR擴(kuò)增體系共20 μL：cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL；反應(yīng)條件：94 ℃ 15 s，94 ℃ 10 s、60 ℃ 35 s、72 ℃ 10 s共35個循環(huán)(miR-191)；95 ℃ 10 s，95 ℃ 40 s、62 ℃ 60 s、72 ℃ 10 s共40個循環(huán)(SATB1 mRNA)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，收集循環(huán)閾值(CT)數(shù)。分別以U6或GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算miR-191、SATB1 mRNA相對表達(dá)量。②SATB1蛋白表達(dá)：采用Western blotting法。取HepG2、L02細(xì)胞各1×105個，加入含PMSF的RIPA裂解液提取細(xì)胞核蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量合格后，加入上樣緩沖液，105 ℃金屬浴15 min，SDS-PAGE分離。電泳結(jié)束，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5% BSA室溫封閉2 h，然后分別加入SATB1、GAPDH一抗，4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。ECL顯色，暗室內(nèi)顯影、定影。Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.4 miR-191和SATB1結(jié)合位點預(yù)測與驗證 借助在線生物信息學(xué)軟件starBase(http：//starbase.sysu.edu.cn/)和TargetScan7.2(http：//www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測miR-191與SATB1的結(jié)合位點。

根據(jù)突變位點分別設(shè)計SATB1野生型(WT)和突變型(MT)質(zhì)粒。將HepG2細(xì)胞接種于24孔板，每孔6×104個，隨機(jī)分為SATB1 WT組、SATB1 MT組、SATB1 WT+miR-191 mimic組、SATB1 MT+miR-191 mimic組。當(dāng)細(xì)胞融合80%～90%時，按Lipofectamine2000瞬時轉(zhuǎn)染試劑說明，SATB1 WT組轉(zhuǎn)染SATB1 WT質(zhì)粒、SATB1 MT組轉(zhuǎn)染SATB1 MT質(zhì)粒、SATB1 WT+miR-191 mimic組轉(zhuǎn)染SATB1 WT質(zhì)粒+miR-191 mimic、SATB1 MT+miR-191 mimic組轉(zhuǎn)染SATB1 MT質(zhì)粒+miR-191 mimic。轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，按Nano-Glo?Dual-Luciferase Reporter (NanoDLRTM) Assay說明檢測各組熒光素酶活性。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將HepG2細(xì)胞接種于12孔板，每孔2×105個，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，隨機(jī)分為對照組、SATB1組、miR-191 mimic組、SATB1+miR-191 mimic組。按Lipofectamine2000瞬時轉(zhuǎn)染試劑說明，對照組轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒，SATB1組轉(zhuǎn)染SATB1過表達(dá)質(zhì)粒，miR-191 mimic組轉(zhuǎn)染miR-191 mimic，SATB1+miR-191 mimic組轉(zhuǎn)染SATB1過表達(dá)質(zhì)粒和miR-191 mimic。轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.6 細(xì)胞增殖能力檢測 將各組轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞接種于96孔板，每孔1×104個，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，分別于0、24、48、72 h加入MTT試劑20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入DMSO 150 μL，振蕩混勻，使結(jié)晶充分溶解。酶標(biāo)儀于560 nm波長處檢測各孔的光密度(OD)值。以O(shè)D560值代表細(xì)胞增殖活性。

1.7 細(xì)胞侵襲能力檢測 將Matrigel用RPMI 1640培養(yǎng)基按1∶8包被Transwell小室底部膜的上室面，37 ℃下靜置30 min。將各組轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞重懸，制成密度為1×105/mL的細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell小室上室，下室加入含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基500 μL。然后將Transwell小室置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，用棉簽輕輕拭去上室面未穿膜細(xì)胞，10%多聚甲醛固定30 min，0.5%結(jié)晶紫染色10 min。顯微鏡下隨機(jī)選取5個400倍不重疊視野，計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。以穿膜細(xì)胞數(shù)代表細(xì)胞侵襲能力。

1.8 Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Cyclin D1、p27蛋白表達(dá)檢測 將各組轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞接種于6孔板，每孔2×105個，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞融合80%～90%時，加入含PMSF的RIPA裂解液提取細(xì)胞核蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量合格后，加入上樣緩沖液，105 ℃金屬浴15 min，SDS-PAGE分離。電泳結(jié)束，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5% BSA室溫封閉2 h，然后分別加入Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Cyclin D1、p27、GAPDH一抗，4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。ECL顯色，暗室內(nèi)顯影、定影。Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 HepG2細(xì)胞與L02細(xì)胞miR-191、SATB1表達(dá)比較 HepG2細(xì)胞與L02細(xì)胞miR-191相對表達(dá)量分別為0.504±0.117、1.312±0.214，SATB1 mRNA相對表達(dá)量分別為1.662±0.326、0.732±0.183，SATB1蛋白相對表達(dá)量分別為0.811±0.220、0.203±0.044。HepG2細(xì)胞miR-191相對表達(dá)量低于L02細(xì)胞(t=6.440，P<0.01)，而SATB1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量均高于L02細(xì)胞(t分別為8.125、8.130，P均<0.01)。

2.2 miR-191與SATB1的靶向調(diào)控關(guān)系 經(jīng)在線生物信息學(xué)軟件starBase和TargetScan7.2預(yù)測，miR-191與SATB1存在相互作用位點，見圖1。SATB1 WT組、SATB1 WT+miR-191 mimic組、SATB1 MT+miR-191 mimic組及SATB1 MT組熒光素酶活性分別為3.117±0.415、1.209±0.227、3.440±0.328、3.246±0.334。SATB1 WT+miR-191 mimic組熒光素酶活性明顯低于SATB1 WT組、SATB1 MT+miR-191 mimic組、SATB1 MT組(t分別為6.136、7.204、6.415，P均<0.01)。

圖1 miR-191與SATB1的結(jié)合位點示意圖

2.3 各組細(xì)胞增殖和侵襲能力比較 見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖和侵襲能力比較

2.4 各組Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Cyclin D1、p27蛋白表達(dá)比較 見表2。

表2 各組Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Cyclin D1、p27蛋白相對表達(dá)量比較

3 討論

肝癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。盡管近年來我國肝癌的發(fā)病率和病死率呈下降趨勢，但我國人口基數(shù)大，肝癌的疾病負(fù)擔(dān)仍然十分嚴(yán)重[11]。目前，肝癌的治療方式包括手術(shù)、放化療、靶向治療等，但肝癌早期癥狀不典型，一旦出現(xiàn)典型癥狀就診時，病情已進(jìn)展至中晚期，治療效果不佳，預(yù)后較差。迄今為止，肝癌發(fā)病的確切分子機(jī)制仍不完全清楚。因此，深入探索肝癌發(fā)病的分子機(jī)制，對尋找肝癌精準(zhǔn)治療的新靶點具有重要意義。

miRNA是一類長度為19～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA分子，由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄合成后被Dicer剪切形成成熟miRNA，參與形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，識別并結(jié)合下游靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)，降低靶基因mRNA的穩(wěn)定性或轉(zhuǎn)錄后抑制靶基因的表達(dá)。miR-191屬于miRNA家族成員之一，定位于人染色體3p21.31。有研究報道，肝癌組織miR-191表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致Kruppel樣因子6(KLF6)等下游靶基因表達(dá)異常增加，繼而引起腫瘤細(xì)胞惡性增殖[12]。SHARMA等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中miR-191表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致下游轉(zhuǎn)錄因子SOX4過表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞miR-191表達(dá)顯著低于L02細(xì)胞。提示miR-191在肝癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用，其表達(dá)下調(diào)的原因可能與miR-191易受表觀遺傳學(xué)修飾調(diào)控有關(guān)。邱必軍等[13]研究表明，肝癌中一些miRNA，如miR-125b、miR-191，存在過度甲基化現(xiàn)象，甲基化修飾可導(dǎo)致肝癌細(xì)胞中miR-191表達(dá)沉默。ZHOU等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌細(xì)胞中miR-191通過與SATB1 mRNA的3′非編碼區(qū)結(jié)合抑制SATB1表達(dá)，從而抑制Wnt信號通路傳導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等惡性生物學(xué)行為。

SATB1是一種組織特異性核基質(zhì)附著區(qū)結(jié)合蛋白，它能以獨特的模式識別并結(jié)合于基質(zhì)附著區(qū)，從而參與染色質(zhì)重塑、組蛋白乙?；图谆刃揎椷^程[7]。SATB1過表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲并抑制其凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8-9]。龔丹等[14]研究表明，在肝癌組織中SATB1存在異常高表達(dá)現(xiàn)象，其異常高表達(dá)能夠激活EGFR、血管內(nèi)皮生長因子等信號通路，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞無限增殖。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與L02細(xì)胞比較，HepG2細(xì)胞SATB1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高，究其原因可能與SATB1表達(dá)受miRNA(如miR-191)轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控有關(guān)。經(jīng)在線生物信息學(xué)軟件starBase和TargetScan7.2預(yù)測，miR-191與SATB1存在結(jié)合位點，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，在HepG2細(xì)胞中miR-191能夠靶向抑制SATB1表達(dá)。因此，肝癌細(xì)胞SATB1表達(dá)受miR-191的靶向調(diào)控。

本研究進(jìn)一步觀察了miR-191/SATB1對肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SATB1過表達(dá)能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖和侵襲能力。有研究報道，SATB1過表達(dá)能夠促進(jìn)下游癌基因(如EGFR)表達(dá)，抑制抑癌基因(如細(xì)胞間黏附分子)表達(dá)[14]。有研究報道，SATB1過表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞Hep3B、Bel-7402凋亡，而敲低SATB1表達(dá)則可抑制Hep3B、Bel-7402細(xì)胞的生長和增殖[15]。本研究還發(fā)現(xiàn)，SATB1過表達(dá)后，HepG2細(xì)胞增殖相關(guān)基因如Cyclin D1和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin表達(dá)升高，表明SATB1過表達(dá)能夠通過激活Cyclin D1表達(dá)促進(jìn)HepG2細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致HepG2細(xì)胞惡性增殖。有研究發(fā)現(xiàn)，SATB1能夠通過促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)換，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)行，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖加快[16]。SATB1能夠通過上調(diào)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路中的間質(zhì)性標(biāo)志物表達(dá)，促進(jìn)HepG2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。此外，HUO等[17]研究發(fā)現(xiàn)，SATB1能夠促進(jìn)p21活化激酶5(PAK5)磷酸化，PAK5激活后促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞局部浸潤和遷移。本研究利用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染miR-191 mimic促進(jìn)miR-191表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞增殖和侵襲能力顯著降低，而轉(zhuǎn)染miR-191 mimic能夠逆轉(zhuǎn)SATB1過表達(dá)，增強(qiáng)HepG2細(xì)胞的增殖和侵襲能力，進(jìn)一步證實miR-191是通過靶向SATB1抑制HepG2細(xì)胞的增殖和侵襲。提示miR-191/SATB1可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化而發(fā)揮作用，二者有可能成為肝癌潛在的治療靶點。

綜上所述，miR-191通過靶向負(fù)調(diào)控SATB1抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲，其機(jī)制可能與miR-191/SATB1軸能夠改變增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1、p27表達(dá)以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白Vimentin、E-cadherin、N-cadherin表達(dá)有關(guān)。