鄧偉明，李道航，孟凡亮

1 安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院心胸外科，安徽巢湖238000；2 安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科

食管癌是上消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是全球第八大常見(jiàn)惡性腫瘤。由于早期癥狀不典型，大多數(shù)食管癌患者就診時(shí)已進(jìn)展至晚期，而對(duì)于晚期食管癌只能采取化療、放療、分子靶向治療等，但治療效果欠佳[1]。目前，食管癌的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。因此，探索食管癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)其早期診斷和靶向治療具有重要意義。非編碼RNA是一類(lèi)不編碼蛋白的RNA，但這類(lèi)RNA在基因轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及翻譯水平具有重要的調(diào)控作用，能夠參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程[2]。微小RNA-122-5p(miR-122-5p)是一種小分子非編碼RNA。有研究報(bào)道，miR-122-5p可作為癌基因或抑癌基因，參與多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等[3-4]。環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1(CREB1)是一種調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)，可通過(guò)調(diào)控下游靶基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、周期調(diào)控等生物學(xué)活動(dòng)，其異常表達(dá)與多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等密切相關(guān)[5-6]。但miR-122-5p、CREB1在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不清楚。本研究觀察了食管癌組織miR-122-5p、CREB1 mRNA表達(dá)變化，并分析其表達(dá)變化與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月—2018年3月安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院收治的食管癌患者92例。所有患者經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合食管癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②初診；③接受根治性或姑息性切除手術(shù)；④術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療；⑤臨床病理資料和術(shù)后隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤者；②合并心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重疾病者；③合并全身感染性疾病者；④合并血液系統(tǒng)疾病者。其中，男56例、女36例，年齡41～87(58.24±7.18)歲；病理類(lèi)型：腺癌32例，鱗癌60例；腫瘤直徑：≥4 cm 45例，<4 cm 47例；組織分化程度：低分化48例，中高分化44例；TNM分期[7]：Ⅰ、Ⅱ期66例，Ⅲ、Ⅳ期26例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移70例。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批編號(hào)：KYXM-202109-018)，患者或其家屬知情同意并簽屬知情同意書(shū)。

1.2 miR-122-5p、CREB1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-qPCR技術(shù)。取手術(shù)切除的胃癌組織及其配對(duì)的癌旁組織(距腫瘤組織邊緣>5 cm，經(jīng)術(shù)后組織病理檢查證實(shí)為正常胃組織)，液氮下充分研磨，采用TRIzol法提取組織總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA完整且純度和濃度合格。按TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。以cDNA為模板，按PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：miR-122-5p上游引物5′-CCGCTCGAGTTCGTGGCTACAGAGTTT-3′、下游引物5′-CCGGAATTCTTTATCGAGGGAAGGATT-3′，內(nèi)參U6上游引物5′-CTTTTCTCCGGAACACAGATTTC-3′、下游引物5′-GATTTGCCAAGTGGGAGGGA-3′；CREB1 mRNA上游引物5′-CGCGGATCCAAATGGACTGGCTTGG-3′、下游引物5′-CGGAATTCTGCCCTATGGAAGAGCTG-3′，內(nèi)參GAPDH上游引物5′-CACTCCTCCACCTTTGA-3′、下游引物5′-CCACCACCCTGTTGCTG-3′。PCR反應(yīng)體系：cDNA模板2 μL，上下游引物各1.5 μL，SYBR Green Master Mix 10 μL，ddH2O 8 μL(miR-122-5p)；cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，SYBR Green Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL(CREB1 mRNA)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性15 s、62 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s共40個(gè)循環(huán)(miR-122-5p)；95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s、62 ℃退火35 s、72 ℃延伸30 s共40個(gè)循環(huán)(CREB1 mRNA)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析，收集循環(huán)閾值(CT)數(shù)。以U6或GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-122-5p、CREB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3 隨訪 所有患者出院后通過(guò)門(mén)診復(fù)查或電話形式定期隨訪3年，隨訪截至2021年3月，統(tǒng)計(jì)術(shù)后3年總生存率。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織與癌旁正常組織miR-122-5p、CREB1 mRNA表達(dá)比較 食管癌組織與癌旁正常組織miR-122-5p 相對(duì)表達(dá)量分別為0.346±0.068、0.953±0.250，CREB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為3.488±0.993、1.419±0.477。食管癌組織miR-122-5p 相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織，CREB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織(t分別為-22.481、18.004，P均<0.01)。

2.2 食管癌組織miR-122-5p表達(dá)與CREB1 mRNA表達(dá)的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析顯示，食管癌組織miR-122-5p 表達(dá)與CREB1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.562，P<0.01)。

2.3 食管癌組織miR-122-5p、CREB1 mRNA表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 見(jiàn)表1。

表1 食管癌組織miR-122-5p、CREB1 mRNA表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 食管癌組織miR-122-5p、CREB1 mRNA表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 截至2021年3月，共隨訪3～36個(gè)月，中位隨訪時(shí)間21個(gè)月，隨訪期間死亡38例。以食管癌組織miR-122-5p相對(duì)表達(dá)量的均數(shù)為臨界值，將患者分為miR-122-5p高表達(dá)者(≥0.346，44例)與低表達(dá)者(<0.346，48例)，miR-122-5p高表達(dá)者與低表達(dá)者術(shù)后3年總生存率分別為70.45%(31/44)、47.92%(23/48)，miR-122-5p高表達(dá)者術(shù)后3年總生存率高于miR-122-5p低表達(dá)者(χ2=7.327，P<0.01)；以食管癌組織CREB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的均數(shù)為臨界值，將患者分為CREB1 mRNA高表達(dá)者(≥3.488，42例)與低表達(dá)者(<3.488，50例)，CREB1 mRNA高表達(dá)者與低表達(dá)者術(shù)后3年總生存率分別為45.24%(19/42)、70.00%(35/50)，CREB1 mRNA高表達(dá)者術(shù)后3年總生存率低于CREB1 mRNA低表達(dá)者(χ2=7.582，P<0.01)。見(jiàn)圖1、2。

圖1 食管癌組織不同miR-122-5p表達(dá)者術(shù)后3年生存曲線

圖2 食管癌組織不同CREB1 mRNA表達(dá)者術(shù)后3年生存曲線

2.5 食管癌患者預(yù)后的影響因素分析 以食管癌患者預(yù)后(死亡=1，存活=0)為因變量，以性別(男=1，女=0)、年齡(≥60歲=1，<60歲=0)、病理分型(腺癌=1，鱗癌=0)、腫瘤直徑(≥4 cm=1、<4 cm=0)、組織分化程度(低分化=1，中高分化=0)、TNM分期(Ⅲ、Ⅳ期=1，Ⅰ、Ⅱ期=0)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有=1，無(wú)=0)、miR-122-5p表達(dá)(≥0.346=1、<0.346=0)、CREB1 mRNA表達(dá)(≥3.488=1、<3.488=0)為自變量，納入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNM分期Ⅲ、Ⅳ期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CREB1 mRNA表達(dá)≥3.488為食管癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而miR-122-5p表達(dá)≥0.346為其獨(dú)立保護(hù)因素(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 食管癌患者預(yù)后的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果

3 討論

食管癌是一種起源于食管黏膜上皮的惡性腫瘤。我國(guó)是食管癌的高發(fā)國(guó)家之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年我國(guó)食管癌新發(fā)病例和死亡病例分別為32.4萬(wàn)例、30.1萬(wàn)例[8]。由于早期癥狀不典型，大多數(shù)食管癌患者就診時(shí)已進(jìn)展至晚期，而對(duì)于晚期食管癌只能采取化療、放療、分子靶向治療等，但治療效果欠佳，5年生存率僅20%～30%[9]。目前，食管癌的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。因此，探索食管癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)其早期診斷和靶向治療具有重要意義。

非編碼RNA是一類(lèi)不編碼蛋白的RNA，包括miRNA、lncRNA、circRNA、piRNA等，雖然不編碼蛋白，但能夠在RNA水平上發(fā)揮多種生物學(xué)功能。miRNA是人體內(nèi)廣泛分布的內(nèi)源性非編碼RNA，長(zhǎng)度一般為21～23個(gè)核苷酸，能夠通過(guò)與mRNA相互作用，降解mRNA或抑制mRNA翻譯，從而調(diào)控靶基因表達(dá)。有研究報(bào)道，miRNA能夠調(diào)控多種癌基因或抑癌基因表達(dá)，從而參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展[10]。miR-122-5p為miRNA家族成員之一，定位于人染色體18q21.31。作為肝臟的特異性miRNA之一，miR-122-5p最初多用于肝臟疾病的早期診斷和病情評(píng)估。YANG等[11]研究報(bào)道，miR-122-5p能夠通過(guò)抑制連環(huán)蛋白δ2抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移。WANG等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-122-5p能夠通過(guò)負(fù)向調(diào)控M2型丙酮酸激酶促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖和遷移。以上研究表明，miR-122-5p在不同腫瘤中發(fā)揮的作用亦不相同。本研究結(jié)果顯示，食管癌組織miR-122-5p相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織，并且其表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-122-5p可能作為抑癌基因參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展。陳?ài)抠s等[13]將miR-122-5p mimic轉(zhuǎn)染食管癌EC109細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，EC109細(xì)胞增殖能力降低、凋亡比例升高，從細(xì)胞水平上佐證了miR-122-5p能夠參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-122-5p高表達(dá)者術(shù)后3年總生存率高于miR-122-5p低表達(dá)者，并且miR-122-5p高表達(dá)為食管癌患者預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素。提示miR-122-5p表達(dá)與食管癌預(yù)后有關(guān)，其表達(dá)越低，患者預(yù)后越差。

CREB是一種選擇性結(jié)合CREs的核蛋白，因能刺激基因轉(zhuǎn)錄，又被稱為轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子?；罨腃REB可參與多種信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，能夠調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)行為[14]。CREB1作為CREB家族中的一員，定位于人染色體2q32-34，可異常啟動(dòng)腫瘤相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，通過(guò)調(diào)控具有細(xì)胞增殖、分化、凋亡等功能的靶基因表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。有研究報(bào)道，CREB1能夠參與卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌等實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[15-16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管癌組織CREB1 mRNA表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，并且其表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示CREB1能夠參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展，其機(jī)制可能與CREB1異常啟動(dòng)腫瘤相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖、分化、遷移等有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CREB1 mRNA高表達(dá)者術(shù)后3年總生存率低于CREB1 mRNA低表達(dá)者，CREB1 mRNA高表達(dá)為食管癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。提示CREB1 mRNA表達(dá)與食管癌預(yù)后有關(guān)，其表達(dá)越高，患者預(yù)后越差。

有研究報(bào)道，在膀胱癌、結(jié)腸癌中miR-122能夠通過(guò)靶向調(diào)控CREB1參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等[17-18]。陳?ài)抠s等[13]通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，miR-122-5p能夠靶向負(fù)調(diào)控CREB1抑制食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。提示在食管癌中miR-122-5p與CREB1存在靶向調(diào)控關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，食管癌組織miR-122-5p表達(dá)與CREB1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，二者可能共同參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展。但miR-122-5p是否通過(guò)靶向調(diào)控CREB1參與食管癌患者預(yù)后尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，食管癌組織miR-122-5p表達(dá)下調(diào)、CREB1 mRNA表達(dá)上調(diào)，二者表達(dá)變化與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后有關(guān)。但本研究樣本量較小且隨訪時(shí)間較短，其結(jié)論還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。