沙娟娟，翟潔敏，鄭莉莉，何劍波

急性腦卒中病人的日常生活能力常受到嚴(yán)重影響，約30%的腦卒中病人常伴隨明顯的精神癥狀，研究發(fā)現(xiàn)，24%的腦卒中病人出現(xiàn)腦卒中后焦慮(post-stroke anxiety，PSA)，且焦慮癥狀可持續(xù)2～5年，導(dǎo)致病情恢復(fù)緩慢，致殘率增加，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量[1-3]。因此，有效地診斷和管理PSA顯得尤為重要。以往的研究主要集中在社會(huì)人口學(xué)和發(fā)病前腦卒中相關(guān)因素的分析，有關(guān)PSA的生物學(xué)機(jī)制尚不明確[1，4]。研究表明，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)參與了腦卒中后神經(jīng)元的可塑和神經(jīng)的發(fā)生，并抑制細(xì)胞凋亡，可能是發(fā)生PSA潛在的生物學(xué)機(jī)制，且BDNF表達(dá)的減少與壓力的易感性增強(qiáng)有關(guān)，使焦慮的患病率明顯增加[1，5]。研究表明，海馬區(qū)神經(jīng)元BDNF的廣泛表達(dá)及其在突觸的長時(shí)程記憶中的作用與焦慮的生物學(xué)機(jī)制密切相關(guān)[1]。同時(shí)，BDNF的表達(dá)受表觀遺傳基因的調(diào)控，在核苷酸196 G/A處具有功能性單核苷酸多態(tài)性(SNP)，即66位點(diǎn)處纈氨酸被蛋氨酸替代(Val66Met)，與普通人群相比，SNP在腦卒中病人中更易出現(xiàn)焦慮癥狀[6-7]。此外，BDNF基因中DNA甲基化還受環(huán)境應(yīng)激因素的影響，通過增加CpG甲基化水平，減少BDNF基因的表達(dá)[1]。腦卒中后抑郁(PSD)與BDNF相關(guān)性研究較多，但有關(guān)BDNF甲基化水平及Val66Met基因多態(tài)性與急性期和慢性期PSA易感性的相關(guān)性動(dòng)態(tài)前瞻性研究較少。本研究擬探討腦卒中2周和1年后BDNF甲基化水平和BDNF Val66Met 基因多態(tài)性與PSA易感性的關(guān)系及其相互作用，為早期識別高風(fēng)險(xiǎn)的PSA病人提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2016年1月—2018年9月在西電集團(tuán)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的急性腦卒中病人268例，隨訪觀察1年，拒絕隨訪和失訪病人60例，納入208例病人，2周后和1年后根據(jù)醫(yī)院焦慮抑郁量表(HADS)將其分為腦卒中2周后病人隊(duì)列(PSA病人25例，非PSA病人243例)和腦卒中1年后病人隊(duì)列(PSA病人33例，非PSA病人175例)，診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[8]。所有入選病人均接受抗血小板聚集、降脂、穩(wěn)定斑塊、護(hù)腦、改善循環(huán)、營養(yǎng)神經(jīng)、減輕水腫等基礎(chǔ)治療。收集所有病人腦卒中后2周和1年后的基線資料，包括年齡、性別、受教育年限、既往史(抑郁史、腦卒中史、高血壓、糖尿病、心臟病、高膽固醇血癥)、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、腦卒中部位。本研究獲得西電集團(tuán)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選者均自愿簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①腦磁共振成像(MRI)診斷為缺血性腦卒中者；②能夠獨(dú)立完成全部調(diào)查和問卷者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重威脅生命或影響腦卒中康復(fù)的疾病，如大面積腦梗死或腦出血等；②言語困難、構(gòu)音障礙等交流障礙者；③其他神經(jīng)、精神合并癥包括癡呆、帕金森病、腦瘤、癲癇、精神病和/或酒精和物質(zhì)依賴性精神病者；④簡易精神狀態(tài)評價(jià)量表(MMSE)<16分者。

1.3 焦慮抑郁及神經(jīng)功能評分測定 采用醫(yī)院焦慮抑郁量表(Hospital Anxiety and Depression Scale，HADS)對腦卒中后2周及1年后病人的焦慮癥狀進(jìn)行測評。由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的主治及以上醫(yī)生進(jìn)行評分，取算術(shù)平均值為最終得分，此量表是包括針對焦慮(HADS-A)和抑郁(HACS-D)癥狀的2個(gè)亞量表，各7個(gè)問題，本研究主要進(jìn)行HADS-A評分，11～21分為確定存在焦慮癥狀，7～10分為可疑焦慮，<7分為無焦慮癥狀，即≥7分可確診為PSA病人[1，9]。神經(jīng)功能缺損程度采用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)評定，分值為 0～45分，神經(jīng)功能缺損程度越嚴(yán)重分值越高。抑郁狀態(tài)應(yīng)用漢密爾頓抑郁量表(Hamilton Depression Scale，HAMD)進(jìn)行評估，≥8分可診斷為PSD。

1.4 BDNF基因甲基化、Val66Met基因多態(tài)性分析 采集靜脈血，提取DNA，使用亞硫酸氫鹽測序法(bisulfite sequencing PCR，BSP)檢測BDNF基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，嚴(yán)格按照甲基化試劑盒操作(QIAGEN公司生產(chǎn))，包括7個(gè)CpG位點(diǎn)、BDNF基因啟動(dòng)子CpG島序列。參考UCSC網(wǎng)站(http://genome.ucsc.edu/)，設(shè)計(jì)相應(yīng)甲基化引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增目的片段，跑膠進(jìn)行膠回收PCR產(chǎn)物測序，分析CpG位點(diǎn)甲基化水平，基于限制性片段長度多態(tài)性-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(restriction fragment length polymorphism-polymerase chain reaction，RFLP-PCR)對BDNF基因上的SNP Val66Met進(jìn)行基因分型(val/val、val/met及met/met)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較 腦卒中后2周和1年均診斷為PSA病人6例，腦卒中后1年P(guān)SA患病率(15.9%)較腦卒中后2周PSA患病率(9.3%)明顯升高(χ2=4.677，P=0.031)。腦卒中后2周時(shí)，與非PSA病人比較，PSA病人年齡較小，女性、抑郁史、PSD、前循環(huán)腦卒中部位占比明顯增加，后循環(huán)腦卒中部位占比明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。腦卒中后1年，與非PSA病人比較，PSA病人女性占比、NIHSS評分、PSD占比、高血壓史占比明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組BDNF基因甲基化水平和Val66Met多態(tài)性基因型比較 腦卒中后2周，與非PSA病人比較，PSA病人Val66Met基因多態(tài)性met/met基因型占比明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；腦卒中后1年，與非PSA病人比較，PSA病人CpG2、CpG9位點(diǎn)及平均CpG 甲基化水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組BDNF基因甲基化水平和Val66Met多態(tài)性基因型比較

2.3 BDNF基因甲基化水平、Val66Met基因多態(tài)性對PSA的影響 將年齡、性別、抑郁史、NIHSS評分、PSD、前循環(huán)腦卒中、后循環(huán)腦卒中、高血壓史、各CpG位點(diǎn)、CpG平均甲基化水平及Val66Met基因多態(tài)性等變量納入單因素Logistic回歸分析，各因素經(jīng)協(xié)變量調(diào)整后，PSD、后循環(huán)腦卒中是腦卒中后2周PSA發(fā)生的影響因素(P<0.05)，性別(女性)、PSD、高血壓是腦卒中后1年P(guān)SA發(fā)生的影響因素(P<0.05)。詳見表3。

表3 腦卒中后2周和1年P(guān)SA影響因素的Logistic回歸分析

2.4 BDNF基因甲基化水平及Val66Met基因多態(tài)性對PSA易感性的多因素Logistic回歸分析 腦卒中后2周，PSA病人易感性與Val66Met基因多態(tài)性中met/met基因型有關(guān)(P<0.05)；腦卒中后1年，PSA易感性與BDNF啟動(dòng)子區(qū)域CpG2、CpG9位點(diǎn)及平均CpG甲基化水平有關(guān)(P<0.05)；在相乘作用模型中，腦卒中后2周 BDNF平均甲基化水平與Val66Met基因多態(tài)性的交互作用對PSA的易感性有關(guān)(P<0.05)。詳見表4。

表4 BDNF基因甲基化水平及Val66Met基因多態(tài)性對PSA易感性的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

PSA是一種多因素影響的疾病，主要受生物學(xué)和表觀遺傳基因調(diào)控，其中BDNF基因表達(dá)的高低與PSA易感性有關(guān)[1]。既往研究表明，DNA甲基化水平調(diào)控BDNF基因的表達(dá)，高甲基化狀態(tài)與BDNF基因的低表達(dá)密切相關(guān)[10]。BDNF是各種神經(jīng)元發(fā)育和生存所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，在神經(jīng)突觸可塑性和長時(shí)程記憶中發(fā)揮著重要作用，參與焦慮癥發(fā)生的病理生理學(xué)機(jī)制[1]。本研究通過建立腦卒中隊(duì)列，探討B(tài)DNF基因甲基化水平、Val66Met基因多態(tài)性及其相互作用與焦慮發(fā)生的關(guān)系，結(jié)果顯示，腦卒中后2周病人(急性期)中PSD、后循環(huán)腦卒中、BDNF Val66Met基因多態(tài)性中met/met基因型的腦卒中病人更易患PSA；腦卒中后1年的PSA病人(慢性期)患病率明顯升高，女性、PSD、高血壓、BDNF基因CpG2、CpG9位點(diǎn)及平均CpG甲基化高水平病人更易患PSA。

大量動(dòng)物模型和群體隊(duì)列研究表明，BDNF基因中高甲基化水平與焦慮發(fā)生有關(guān)[1，11-12]。本研究結(jié)果顯示，BDNF基因的高甲基化水平與PSA發(fā)生率有關(guān)。雖然本研究未檢測BDNF基因的表達(dá)量，但以往研究證實(shí)，PSA病人存在較低的BDNF基因表達(dá)水平，BDNF水平的降低可能會(huì)干擾腦卒中病人的杏仁核和海馬區(qū)對恐懼情緒的處理，使腦卒中病人長期處于高度緊張狀態(tài)，逐漸出現(xiàn)腦卒中后焦慮癥狀[3，10]。情緒穩(wěn)定劑和心理治療方法在內(nèi)的干預(yù)治療有助于降低BDNF的高甲基化水平，且治療前甲基化狀態(tài)越高，治療效果越好[1]。在本研究中，腦卒中后1年的PSA病人BDNF基因存在較高的甲基化水平，而BDNF Val66Met基因多態(tài)性中met/met基因型與腦卒中后2周的PSA的發(fā)生有關(guān)，腦卒中后1年P(guān)SA發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)與BDNF甲基化水平變化有關(guān)，而與BDNF基因多態(tài)性無關(guān)。影響焦慮的機(jī)制有：①慢性壓力(殘疾、失業(yè)、經(jīng)濟(jì)壓力等)可引起腦循環(huán)糖皮質(zhì)激素水平升高，干擾BDNF基因的表達(dá)，加劇焦慮的發(fā)生，BDNF甲基化水平可能僅在腦卒中后1年對焦慮的發(fā)展起直接作用，如BDNF基因甲基化水平與海馬回結(jié)構(gòu)神經(jīng)環(huán)路相關(guān)，此部位主要參與焦慮形成相關(guān)的恐懼情緒的調(diào)節(jié)以及記憶鞏固、恢復(fù)調(diào)節(jié)的重要部位，主要參與應(yīng)激反應(yīng)情緒的調(diào)節(jié)與BDNF mRNA水平的調(diào)節(jié)[1，14-15]；②在腦卒中急性期(2周內(nèi))，生物因素的變化導(dǎo)致腦卒中病人產(chǎn)生代償性或適應(yīng)性應(yīng)激反應(yīng)，BDNF的變化可能增加PSA的風(fēng)險(xiǎn)。已有研究表明，Val66Met基因多態(tài)性對焦慮的發(fā)生具有易感性，目前的研究表明，BDNF基因多態(tài)性在腦卒中病人慢性期的焦慮癥狀中并不具有相關(guān)性，但腦卒中后2周PSA的發(fā)生可能與BDNF高甲基化水平及Val66Met基因多態(tài)性中met/met基因型的共同作用有關(guān)，兩者都降低BDNF基因的表達(dá)，未來仍需要進(jìn)一步擴(kuò)大腦卒中樣本來研究BDNF基因甲基化水平及Val66Met基因多態(tài)性與焦慮發(fā)生的關(guān)系[16]。

本研究通過對BDNF基因甲基化水平及Val66Met基因多態(tài)性與PSA易感性的研究發(fā)現(xiàn)，BDNF基因甲基化水平改變可作為PSA發(fā)生的易感性潛在生物標(biāo)志物，應(yīng)密切監(jiān)測BDNF基因平均甲基化水平較高的腦卒中病人，以確定焦慮的發(fā)生情況，特別是在腦卒中后的慢性期。而在腦卒中的急性期中，具有Val66Met基因多態(tài)性中met/met基因型的病人也應(yīng)密切關(guān)注其焦慮的發(fā)生情況。由于目前BDNF甲基化水平與Val66Met基因多態(tài)性檢測相結(jié)合是相對無創(chuàng)的，且隨著時(shí)間的推移，這些值的變化在生物學(xué)上是穩(wěn)定的，通過簡單的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測有助于確定腦卒中病人PSA發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。此外，藥物治療如使用DNA甲基化抑制劑可以逆轉(zhuǎn)甲基化水平，具有明顯的抗焦慮作用，有助于開發(fā)針對PSA治療的新靶點(diǎn)藥物。