周熒，張志存

南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，江蘇淮安223300

據(jù)估算，2021年美國喉癌新增病例14 250 例，死亡4 113 例[1]。新發(fā)喉癌病例約占所有新發(fā)癌癥病例的0.8%，其死亡率約占所有癌癥死亡率的0.6%[2]。隨著煙草使用的減少，過去10年中，喉癌的發(fā)病率每年下降2.4%[2-3]。但值得注意的是，喉癌的5年生存率約為60.9%，在過去數(shù)年中幾乎沒有變化[2,4]。早期T1 和T2 腫瘤的治愈率高達(dá)80%～90%。相反，在出現(xiàn)晚期喉癌的患者中，生存率降低至40%。喉癌需要復(fù)雜的治療策略和長期的隨訪，給患者帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，顯著降低患者生活質(zhì)量[5-6]。目前對喉癌患者的預(yù)后相關(guān)因素的研究多集中于性別、年齡、腫瘤分期分級和治療方案等。研究[7]表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和治療方案是喉癌患者預(yù)后的獨立危險因素。也有研究[8]指出，術(shù)前血小板淋巴細(xì)胞的比值可用于判斷喉癌患者預(yù)后。近年來的一些研究[9-10]發(fā)現(xiàn)了一些與喉癌預(yù)后相關(guān)的基因，包括等。但是基于基因表達(dá)量精準(zhǔn)評估患者生存率的研究相對較少。本研究旨在針對老年喉癌患者，篩選喉癌中差異表達(dá)的mRNA 以及預(yù)后相關(guān)mRNA，并構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險評估模型，從而將喉癌患者預(yù)后評估量化，更加直觀的判斷患者預(yù)后。

1 資料和方法

1.1 一般資料 從 TCGA 數(shù)據(jù)庫和 GEO 下載（GSE142083, GSE117007 和GSE127165）喉癌RNASeq 和臨床信息數(shù)據(jù)集，臨床數(shù)據(jù)信息包括患者年齡、性別、腫瘤分級、腫瘤分期、生存時間和生存狀態(tài)等。本研究針對老年喉癌患者，因此篩選年齡＞60 歲的樣本，其中喉癌組織163 例，正常喉組織43 例。163例喉癌患者臨床資料如表1 所示。

表1 喉癌患者一般資料

1.2 方法

1.2.1 矩陣整理 將下載的TCGA 數(shù)據(jù)集和GEO 數(shù)據(jù)集整理為行名為基因代碼，列名為樣本信息，內(nèi)容為基因相對表達(dá)量的數(shù)據(jù)矩陣。將數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換。合并TCGA 矩陣和GEO 矩陣，并進(jìn)行批次校準(zhǔn)，去除實驗條件對基因表達(dá)量的影響。

1.2.2 差異表達(dá)基因篩選 根據(jù)Ensemble 數(shù)據(jù)庫中人源性基因信息篩選指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的mRNA。使用R軟件和edge R包對喉癌組織和正常喉組織進(jìn)行差異分析，計算mRNA 差異表達(dá)倍數(shù)（fold change, FC）。計算公式為FC=喉癌平均表達(dá)量/正常喉組織表達(dá)量。計算結(jié)果進(jìn)行對數(shù)運算，最終以log2FC 的形式表達(dá)。本研究喉癌組織差異表達(dá)mRNA 篩選的2 個條件為（1）log2FC 絕對值＞2；（2）錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rates，F(xiàn)DR）＜0.05。

1.2.3 預(yù)后相關(guān)基因篩選 整理喉癌患者臨床資料中的生存狀態(tài)和生存時間。通過單因素COX 分析篩選與預(yù)后相關(guān)的差異表達(dá)mRNA。篩選標(biāo)準(zhǔn)為0.001。根據(jù)基因表達(dá)量中位數(shù)將患者分為表達(dá)組和低表達(dá)組。使用Kaplan-Meier Plotter 曲線進(jìn)行生存分析，并使用Log-Rank 檢驗。

1.2.4 預(yù)后評估模型建立與評價 通過多因素COX 分析，構(gòu)建預(yù)后評估模型，根據(jù)預(yù)后模型評分將喉癌患者分為高危組與低危組，使用Kaplan-Meier Plotter 曲線進(jìn)行生存分析，并使用Log-Rank 檢驗。使用ROC曲線對預(yù)后評估模型進(jìn)行評價。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 本研究使用R 軟件（V3.5.1）和相關(guān)R 包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)的mRNA篩選 共篩選出1 796 個mRNA在喉癌患者腫瘤組織和正常喉組織中的表達(dá)量存在明顯差異(|log2FC|＞2, FDR＜0.05)，其中835 個mRNA表達(dá)上調(diào)，961 個mRNA 表達(dá)下調(diào)。以下是差異表達(dá)最顯著的前20 個mRNA。見表2。

表2 差異表達(dá)最顯著的前20 個基因

2.2 差異表達(dá)mRNA 預(yù)后相關(guān)性分析 基于喉癌組織和正常組織中差異表達(dá)的mRNA，同時結(jié)合樣本的生存時間和生存狀態(tài)，本研究進(jìn)行單因素COX 分析。以＜0.001 為篩選條件，共有16 個mRNA 與患者預(yù)后相關(guān)。其中，13 個mRNA 為影響預(yù)后的危險因素，表達(dá)量越高，患者預(yù)后越差（Hazard ratio＞1,＜0.001）；3 個mRNA 為影響預(yù)后的保護(hù)因素，表達(dá)量越高，預(yù)后越好（Hazard ratio＞1,0.001）。見表3。

表3 差異免疫基因預(yù)后相關(guān)性分析

2.3 預(yù)后評估模型建立 基于單因素COX 篩選結(jié)果，進(jìn)一步通過多因素COX 分析構(gòu)建預(yù)后評估模型。預(yù)后評估模型計算公式為危險評分=CCR8×0.129+CDC20×0.086+TFPI-2×0.096。構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險評估模型的mRNA 森林圖。見圖1。

圖1 構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險評估模型的mRNA 森林圖

2.4 高風(fēng)險患者與低風(fēng)險患者生存分析 根據(jù)預(yù)后風(fēng)險值計算公式計算所有樣本風(fēng)險值。以中位值為界限，高于中位值的為高風(fēng)險患者，低于中位值的為低風(fēng)險患者。對高風(fēng)險患者和低風(fēng)險患者進(jìn)行生存分析，低風(fēng)險患者預(yù)后顯著優(yōu)于高風(fēng)險患者＜0.001）。見圖2。

圖2 高風(fēng)險患者與低風(fēng)險患者生存分析

2.5 預(yù)后風(fēng)險評估模型評價使用ROC曲線評價預(yù)后風(fēng)險評估模型。曲線下面積為0.797，大于0.6，表明預(yù)后風(fēng)險評估模型效能較好。

圖3 預(yù)后風(fēng)險評估模型ROC 曲線

3 討論

淋巴結(jié)受累是影響生存最重要的預(yù)后因素[11-12]。淋巴結(jié)受累的喉癌患者5年存活率僅有未累及淋巴結(jié)患者生存率的一半。喉癌累及部位對患者預(yù)后也存在一定影響。聲門腫瘤比聲門上或聲門下腫瘤預(yù)后更好。原發(fā)腫瘤體積與放療獲得的局部控制率密切相關(guān)。放療時間與局部控制率和存活率均相關(guān)。氣管切開被證明降低患者存活率，可能與增加了造口復(fù)發(fā)的風(fēng)險相關(guān)[11-12]。此外，一些基因（如和在喉癌中的表達(dá)量增加，BCL2 可能對喉癌的預(yù)后有影響[13-14]。TNM 分類不足以區(qū)分喉癌患者預(yù)后類別，往往忽略了一些高度惡性的因素[11-12]。本研究旨在針對老年喉癌患者，篩選喉癌差異表達(dá)的mRNA 以及預(yù)后相關(guān)的mRNA，并構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險評估模型，以期為臨床決策提供依據(jù)。

本研究通過公共數(shù)據(jù)庫對喉癌組織和喉正常組織全轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，相較正常組織篩選出喉癌組織中差異表達(dá)的mRNA。本研究共篩選出1 796 個mRNA在喉癌患者腫瘤組織和正常喉組織中的表達(dá)量存在明顯差異，其中表達(dá)上調(diào)的mRNA 有835 個，表達(dá)下調(diào)的mRNA 有961 個。進(jìn)一步結(jié)合差異表達(dá)mRNA表達(dá)量和樣本生存信息進(jìn)行了單因素COX 分析，篩選出與預(yù)后相關(guān)的16 個mRNA。值得注意的是，其中部分基因在喉癌中的作用已經(jīng)得到了研究或證實。郭星等[15]通過喉癌組織和癌旁正常黏膜組織標(biāo)本采用免疫組化實驗證實，BRMS1 在癌旁正常黏膜組織中高表達(dá)，而CD44v 在喉癌組織中高表達(dá)。且2 種蛋白表達(dá)量負(fù)相關(guān)。該研究還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CD44v 高表達(dá)患者預(yù)后差于CD44v 低表達(dá)患者。胡俊蘭等[16]通過20 例癌旁組織和12 例正常喉黏膜組織，采用流式細(xì)胞術(shù)同樣證實CD44v 在喉癌組織中高表達(dá)。鄭剛等[17]通過分析TCGA公共數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)HOXA13在喉癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)量越高，患者生存率越低。其研究還證實HOXA13 是喉癌預(yù)后獨立危險因素。何時知等[18]通過基因表達(dá)譜芯片篩選發(fā)現(xiàn)BMP1在喉癌組織中高表達(dá)，并認(rèn)為是關(guān)鍵致病基因，且其表達(dá)量與腫瘤分期正相關(guān)。

預(yù)后評估模型計算公式為危險評分=CCR8×0.129+CDC20×0.086+TFPI-2×0.096。本研究采用的危險評分公式是基于COX 比例風(fēng)險模型構(gòu)建的。這是一種半?yún)?shù)回歸模型，可以用于分析一個或多個前定變量對患者生存時間的影響。使用這一模型建立了積累生存函數(shù)，即本研究的危險評分公式。在構(gòu)建模型的3 個基因中，早期研究[19]認(rèn)為，CDC20 可以介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞APC/C 檢查抑制。近年來的研究[20]證實，CDC20 在肺腺癌和食管癌中均起到促癌作用，并且與預(yù)后不良密切相關(guān)。研究[21]證實，CCR8 可以介導(dǎo)Akt/PRAS40/mTOR 通路參與食管鱗癌進(jìn)展；CCR8 重編程乳酸脫氫酶亞型表達(dá)與腫瘤的不良臨床結(jié)局相關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)，在肌肉浸潤性膀胱癌中CCR8 通過腫瘤內(nèi)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的不穩(wěn)定引發(fā)抗腫瘤免疫。由此可見CCR8 在多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[22]。有研究證實，TFPI-2 的表觀遺傳失活是與胰腺導(dǎo)管腺癌的生長和侵襲相關(guān)的常見機(jī)制[23]。TFPI-2 在宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌中均發(fā)揮重要的致病作用[24-25]。近年來的一些研究發(fā)現(xiàn)了一些與喉癌預(yù)后相關(guān)的基因，包括等。但是這些研究也僅僅明確了基因表達(dá)量高低與預(yù)后的相關(guān)性，并沒有依據(jù)嚴(yán)格的統(tǒng)計學(xué)方法建立直觀預(yù)測患者生存率的模型。另外，也有研究證實臨床變量，包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤原發(fā)灶大小、治療方案選擇等，可用于判斷患者預(yù)后。本研究構(gòu)建的模型具有獨特的優(yōu)勢，一是可以基于基因表達(dá)進(jìn)行計算，精準(zhǔn)預(yù)測患者生存率；二是ROC 曲線證實模型效能較好；三是模型公式納入變量少，臨床應(yīng)用便捷。

本研究發(fā)現(xiàn)通過該模型區(qū)分患者高風(fēng)險與低風(fēng)險，低風(fēng)險患者預(yù)后較高風(fēng)險患者預(yù)后好。ROC 曲線評價預(yù)后風(fēng)險評估模型，曲線下面積為0.797，大于0.6，表明預(yù)后風(fēng)險評估模型效能較好。

本研究篩選出了喉癌中差異表達(dá)的mRNA，并確定了與預(yù)后相關(guān)的差異表達(dá)mRNA，據(jù)此構(gòu)建了預(yù)后風(fēng)險評估模型，可以準(zhǔn)確評估喉癌患者生存率，將患者預(yù)后和基因表達(dá)量進(jìn)行結(jié)合，以期為臨床決策提供依據(jù)。本研究存在一些缺陷：一是缺乏外部數(shù)據(jù)對模型進(jìn)行驗證；二是缺乏體內(nèi)和體外實驗進(jìn)行驗證，這些基因在喉癌中的致病機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步的研究明確。

綜上所述，CDC20、CCR8 和TFPI-2 在喉癌組織中高表達(dá)，與預(yù)后不良相關(guān)，可能是喉癌關(guān)鍵致病基因和潛在指標(biāo)靶點。本研究構(gòu)建的預(yù)后風(fēng)險評估模型，效能較好，可以準(zhǔn)確預(yù)測喉癌患者預(yù)后情況。