韓凱凱，嚴若峰，劉青濤，劉宇卓，李 銀，趙冬敏，黃欣梅，章麗嬌，楊 婧，付 晨

(1.南京農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 獸醫(yī)研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇大學 生命科學學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

2010年春季以來，在我國華東地區(qū)，如上海、江蘇、浙江等地陸續(xù)爆發(fā)一種導致鴨、鵝產(chǎn)蛋量急劇下降的新發(fā)疾病，鴨、鵝感染后一般表現(xiàn)出高熱、食欲下降甚至廢絕、運動障礙、產(chǎn)蛋減少甚至停止，死亡率可達5%～10%[1-5]。鴨、鵝死亡后剖檢病理變化多集中于卵巢，表現(xiàn)為卵巢出血、萎縮、破裂，患病動物后期出現(xiàn)典型的神經(jīng)癥狀，偏癱、倒地震顫，最終衰竭死亡。該病爆發(fā)后從華東地區(qū)向中西部地區(qū)快速擴散，幾乎席卷了大部分水禽養(yǎng)殖密集地區(qū)，給我國鴨、鵝養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失[6-11]。通過實驗室檢測，目前已經(jīng)證明引起該病的病原為坦布蘇病毒(Tembusuvirus，TMUV)[12]。

坦布蘇病毒屬于黃病毒科(Flaviviridae)，黃病毒屬(Flavivirusgenus)，是一種不分節(jié)段的單股正鏈RNA 病毒，含有單一的開放讀碼框，編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM和E)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[13]。非結(jié)構(gòu)蛋白NS5大約100 ku，是這10種編碼蛋白中分子量最大的，整個NS5蛋白一般認為可以劃分成2個功能域，N端為甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，C端為RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)結(jié)構(gòu)域。黃病毒屬病毒如乙型腦炎病毒、西尼羅河病毒、登革病毒、寨卡病毒等都編碼有RNA依賴的RNA聚合酶功能基團，該功能基團與病毒編碼的其他蛋白酶(如NS3蛋白的解旋酶)以及一些宿主因子共同構(gòu)成病毒的復制酶系統(tǒng)，在宿主細胞內(nèi)調(diào)控病毒基因組的復制功能。其中，RdRp蛋白在整個復制酶系統(tǒng)中處于核心地位[14]。研究證明，黃病毒屬病毒RdRp功能基團起始合成病毒基因組RNA的分子機制主要有2種：一種是引物依賴的RNA合成(Primer-dependent RNA synthesis)，另一種是引物非依賴的RNA合成，即從頭合成(de-novo RNA synthesis)[15]。因此，明晰坦布蘇病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS5重要功能基團-RdRp蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，對于深入研究坦布蘇病毒的復制機制和調(diào)控機理等具有十分重要的意義。本研究通過開展DTMUVRdRp分子重組真核質(zhì)粒的構(gòu)建和表達，同時對其蛋白理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及功能進行生物信息學分析與預測，旨在闡述DTMUV的復制機制以及DTMUV蛋白與宿主蛋白的相互作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為研制治療DTMUV的藥物提供靶向位點信息和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒、細胞和載體

坦布蘇病毒分離株(JS804)、BHK-21細胞株、真核表達載體pCMV-N-Flag(購自碧云天公司)均由禽病與生物獸藥研究室保存。E.coliDH5α感受態(tài)細胞購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要試劑

體液病毒核酸提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購自Axygen生物科技有限公司；ExTaqDNA聚合酶、各類限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、pMD19-T載體均購自寶生物工程(大連)有限公司；蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準購自Thermo Fisher公司；細胞培養(yǎng)用DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清均購自Gibco公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 3000購自Invitrogen公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG購于北京中杉金橋公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗小鼠IgG購于碧云天公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中登錄的坦布蘇病毒JS804株(GenBank No.JF895923)NS5基因序列，設(shè)計1對PCR 擴增引物，其中上游引物為RdRp-F：5′-CAAGAATTCCCTTACAAGACTTGGAACTA-3′，劃線部分為插入的EcoR Ⅰ酶切位點。下游引物為RdRp-R：5′-CTCCTCGAGTTACAAGACACCTTCACTCC-3′，劃線部分為插入的XhoⅠ酶切位點。設(shè)計好的引物送南京金斯瑞生物有限公司合成，預期PCR擴增片段大小約為1 800 bp。

1.4 TMUV RdRp基因的擴增

按照Axygen公司體液病毒核酸提取試劑盒說明書進行操作，首先提取鴨坦布蘇病毒JS804株的總RNA，進一步根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求，生成cDNA。PCR以生成的cDNA為模板，公司合成的RdRp-F和RdRp-R為引物進行擴增。PCR擴增體系(25 μL)如下：其中雙蒸水15 μL，10×ExPCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，RdRp-F和RdRp-R(20 pmol/mL)各1 μL，cDNA模板1.5 μL，ExTaq(5 U/μL)0.5 μL。PCR反應程序如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，33次循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。PCR反應結(jié)束后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，如有疑似目的條帶，按照Axygen公司瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒操作說明，進行PCR產(chǎn)物的回收與純化。回收的片段根據(jù)TaKaRa公司pMD19-T載體說明書進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞中，涂布于LB固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，倒置過夜培養(yǎng)，第2天挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)5 h，用PCR引物對菌液進行PCR鑒定。取鑒定正確的菌液1 mL送至上海生工生物科技有限公司作測序分析，鑒定正確后，按照Axygen公司質(zhì)粒小量提取試劑盒操作說明，提取重組克隆質(zhì)粒pMD19-T-RdRp。

1.5 重組質(zhì)粒pCMV-Flag-RdRp的構(gòu)建

利用TaKaRa公司限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、XhoⅠ對重組克隆質(zhì)粒pMD19-T-RdRp和真核表達載體pCMV-N-Flag進行雙酶切處理，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后切膠回收，將目的基因片段、pCMV-N-Flag真核表達載體片段按照適宜比例與T4DNA連接酶16 ℃連接過夜。第2天將過夜的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞中，并涂布于含有卡那霉素抗性的瓊脂平板，倒置后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，第2天先挑取單菌落進行菌液PCR鑒定，將PCR鑒定正確的目標菌液再次擴大培養(yǎng)并提取真核質(zhì)粒，EcoR Ⅰ、XhoⅠ雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳分析，酶切鑒定有目的條帶的克隆產(chǎn)物送至上海生工生物科技有限公司測序，將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為pCMV-Flag-RdRp。

1.6 BHK-21細胞的轉(zhuǎn)染

根據(jù)Axygen公司質(zhì)粒小量提取試劑盒要求提取真核表達質(zhì)粒pCMV-Flag-RdRp，核酸定量分析儀測定其濃度。10%胎牛血清傳代培養(yǎng)BHK-21細胞，待其處于對數(shù)生長期時，胰酶消化細胞，取一定數(shù)目的細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，加入含有10%胎牛血清的DMEM營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞鋪至細胞板約80%～90%時進行轉(zhuǎn)染。按照Invitrogen公司lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑操作要求，將真核表達質(zhì)粒pCMV-Flag-RdRp與脂質(zhì)體按照適宜比例混合，制備DNA-脂質(zhì)體混合物?；旌衔镏糜谑覝胤跤?0 min，然后將DNA-脂質(zhì)體混合物均勻加入BHK-21細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，移除含有混合物的營養(yǎng)液，加入含10%胎牛血清的DMEM營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.7 間接免疫熒光鑒定

真核質(zhì)粒pCMV-Flag-RdRp轉(zhuǎn)染BHK-21細胞24 h后，移除培養(yǎng)液，用PBS洗滌BHK-21細胞3次，加入300 μL 4%多聚甲醛固定BHK-21細胞8 min；移除多聚甲醛溶液，PBS洗滌細胞3次，每次5 min，繼續(xù)加入0.5% Triton X-100作用10 min，對細胞進行透化處理，PBS洗滌細胞3次，每次5 min；每孔加入1% BSA，室溫封閉30 min；PBS洗滌細胞3次，每次5 min，然后加入水禽疫病防控團隊先期制備的坦布蘇病毒陽性小鼠血清(1∶1 000)，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，每次5 min，最后加入FITC標記的山羊抗小鼠IgG(1∶400)，于室溫環(huán)境孵育30 min，加入PBS洗滌細胞3次，每次5 min，倒置熒光顯微鏡下觀察，照相記錄。

1.8 Western Blot鑒定

pCMV-N-Flag以及pCMV-Flag-RdRp分別轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，轉(zhuǎn)染48 h后分別加入400 μL RIPA裂解液裂解細胞，離心后取蛋白上清，長時間放置可分裝保存。于蛋白定量檢測儀上分別測定2種蛋白濃度后，經(jīng)Western Blot檢測RdRp蛋白的表達情況。首先對2種蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，通過電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)到PVDF膜上，加入1% BSA，于37 ℃封閉1 h。然后以本實驗室制備保存的抗坦布蘇病毒陽性小鼠血清(稀釋比例1∶1 000)為一抗，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(稀釋比例1∶10 000)為二抗進行反應，ECL顯影觀察結(jié)果并拍照記錄。

1.9 生物信息學分析

針對非結(jié)構(gòu)蛋白NS5重要功能基團RdRp，采用一系列生物信息學軟件對其展開分析。首先采用在線分析軟件Prot-Param Tool(http://web.expasy.org/protparam)分析RdRp蛋白氨基酸組成、等電點等基礎(chǔ)理化性質(zhì)。采用ProtScale(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/StructureE-Cdd/wrpsb.cgi#userconsent#)分析RdRp蛋白的疏水性。采用TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)針對RdRp蛋白的跨膜區(qū)展開預測。采用SignalIP 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalIP-4.0)就RdRp蛋白的信號肽展開預測。磷酸化位點、N-糖基化位點和O-糖基化位點分別使用NetPhos 3.1、NetNGlyc 1.0、YinOYang 1.2在線軟件進行預測；采用Prabi服務器的SOPMA程序(http：//npsa-prabi.Ibcp.fr/)預測RdRp蛋白的二級結(jié)構(gòu)；采用SWISS-MODEL軟件(http://npsa-prabi.Ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl)預測RdRp蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨坦布蘇病毒RdRp基因的PCR擴增

以鴨坦布蘇病毒cDNA為模板，加以一對針對RdRp基因的特異性引物，通過PCR方法擴增RdRp基因全長，結(jié)果PCR擴增的片段大小約為1 800 bp(圖1)，與預期片段大小相符。

M.DL2000 分子量Marker；1.RdRp擴增片段。M.DL2000 Marker；1.RdRp fragment.

2.2 重組質(zhì)粒pCMV-Flag-RdRp的PCR和雙酶切鑒定

菌液PCR結(jié)果顯示，挑取的單克隆可以擴增得到與RdRp大小一致的DNA片段(圖2)。同時利用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、XhoⅠ對重組質(zhì)粒pCMV-Flag-RdRp進行雙酶切鑒定，通過凝膠電泳分析，結(jié)果出現(xiàn)2條特異性的目的條帶(圖2)，一條大小約為4 300 bp，為pCMV-N-Flag載體條帶，另一條大小1 800 bp，與RdRp大小一致。測序結(jié)果經(jīng)Blast比對顯示，通過PCR方式擴增得來的RdRp基因序列與GenBank上發(fā)布的RdRp基因序列同源性達99%，氨基酸同源性100%，說明PCR過程中產(chǎn)生的基因突變對RdRp蛋白編碼沒有影響。以上結(jié)果都表明，真核質(zhì)粒pCMV-Flag-RdRp構(gòu)建成功。

M.DNA分子質(zhì)量標準；1-2.DTMUV RdRp基因的PCR產(chǎn)物；3.pCMV-Flag-RdRp雙酶切產(chǎn)物。M.DL2000 Marker；1-2.PCR products of DTMUV RdRp；3.Double enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pCMV-Flag-RdRp.

A. pCMV-Flag-RdRp重組真核質(zhì)粒；B.正常BHK-21空白對照。A.Recombinant plasmid pCMV-Flag-RdRp； B.Normal BHK-21 cell control.

2.3 重組質(zhì)粒pCMV-Flag-RdRp轉(zhuǎn)染檢測

用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 3000介導pCMV-Flag-RdRp轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，間接免疫熒光檢測RdRp表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒pCMV-Flag-RdRp轉(zhuǎn)染細胞能夠觀測到綠色熒光，且熒光多數(shù)位于細胞質(zhì)中，正常未轉(zhuǎn)染細胞無綠色熒光(圖3)，以上結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pCMV-Flag-RdRp能于BHK-21細胞中轉(zhuǎn)染并表達，其轉(zhuǎn)染效率未受外源插入蛋白的影響。

2.4 DTMUV RdRp在BHK-21細胞中的表達

經(jīng)Western Blot檢測，重組DTMUV RdRp蛋白與坦布蘇病毒陽性小鼠血清能發(fā)生特異性結(jié)合，條帶分子量大小位于約70 ku處，表明重組DTMUV RdRp蛋白具有免疫反應活性，結(jié)果見圖4。

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1.pCMV-N-Flag載體；2.pCMV-Flag-RdRp目的蛋白。M. Protein standard ladder；1. pCMV-N-Flag vector；2. pCMV-Flag-RdRp target protein.

2.5 DTMUV RdRp的生物信息學分析

首先使用ProtParam軟件對DTMUV RdRp的基礎(chǔ)理化性質(zhì)進行分析。結(jié)果表明，DTMUVRdRp基因全長1 818 bp，共編碼606個氨基酸，總分子式為C3091H4810N870O894S41，理論蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為69.777 9 ku，正電荷殘基(精氨酸+賴氨酸)83個，負電荷殘基(天冬氨酸+谷氨酸)81個，等電點為7.94。同時發(fā)現(xiàn)，RdRp蛋白質(zhì)親水性平均系數(shù)為-0.536，為親水性蛋白質(zhì)。進一步分析發(fā)現(xiàn)其消光系數(shù)為160 475，脂肪指數(shù)為70.15，不穩(wěn)定指數(shù)為42.15(>40)，表明該蛋白可能為不穩(wěn)定性蛋白質(zhì)。半衰期預測顯示，該蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的半衰期大于10 h，在酵母中的半衰期大于20 h，在哺乳動物網(wǎng)織紅細胞中的半衰期為30 h。

采用軟件ProtScale對RdRp蛋白的疏水性進行分析，結(jié)果如圖5所示，其中負值表示親水，正值表示疏水，結(jié)果顯示，該蛋白第529位氨基酸的親疏水性分值最低，為-2.911，323位氨基酸分值最高為1.689(圖5)。

圖5 DTMUV RdRp蛋白的疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis of DTMUV RdRp protein

采用軟件Tmpred對RdRp蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果顯示該蛋白存在3個潛在跨膜區(qū)，位于第173-192位，306-324位，481-497位氨基酸(圖6)。

圖6 DTMUV RdRp蛋白的潛在跨膜區(qū)分析Fig.6 The potential transmembrane domain analysis of DTMUV RdRp protein

磷酸化位點的預測結(jié)果表明，該蛋白含有84個潛在的磷酸化位點。N-糖基化位點預測結(jié)果顯示，該蛋白序列沒有潛在的N-糖基化位點，O-糖基化位點預測結(jié)果顯示，該蛋白序列有9個潛在的O-糖基化位點，分別位于17，310，367，487，488，492，534，537，564位。SignalP 5.0 Server對其信號肽的預測分析表明，DTMUV RdRp蛋白不存在信號肽區(qū)域。DTMUV RdRp蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成(圖7)，其中α-螺旋占46.37%，無規(guī)則卷曲占35.31%，延伸鏈占12.54%。運用SWISS-MODEL軟件預測了DTMUV RdRp蛋白可能存在的三級結(jié)構(gòu)(圖8)。

c和短線.無規(guī)則卷曲；h和長豎線.α-螺旋；e和中長豎線.延伸鏈。c and short line.Random coil；h and long line.α-helix；e and mid-long line.Extending strand.

圖8 DTMUV RdRp蛋白三級結(jié)構(gòu)預測Fig.8 The prediction of tertiary structure of DTMUV RdRp protein

3 討論和結(jié)論

本研究利用RT-PCR方法擴增出DTMUVRdRp基因，亞克隆至pCMV-N-Flag真核表達載體中，并轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞，通過間接免疫熒光觀察和Western Blot鑒定該蛋白的表達。同時利用生物信息學軟件分別對RdRp蛋白的序列進行分析，對結(jié)構(gòu)和功能進行預測。本研究結(jié)果顯示，DTMUVRdRp能夠在真核細胞中穩(wěn)定高效表達，對DTMUV RdRp的生物信息學預測結(jié)果同時顯示，該目的蛋白含有84個潛在的磷酸化位點和9個潛在的O-糖基化位點。糖基化修飾具有重要的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能作用，蛋白經(jīng)過糖基化修飾后，對后續(xù)參與免疫反應有重要的實際意義[16]。而磷酸化的作用則主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)、控制蛋白質(zhì)活力與功能等，同時擁有控制細胞增殖、分化等生命活動能力[17]。非結(jié)構(gòu)蛋白NS5重要功能基團RdRp蛋白是否通過糖基化或磷酸化、或兩者兼有參與坦布蘇病毒在體內(nèi)復制過程中病毒多聚蛋白的生成，還需要后續(xù)更多試驗研究加以驗證。

黃病毒屬病毒RdRp屬于非結(jié)構(gòu)蛋白NS5功能基團，該功能基團與病毒編碼的其他蛋白酶(如NS3蛋白的解旋酶)以及一些宿主因子共同構(gòu)成病毒的復制酶系統(tǒng)，在宿主細胞內(nèi)調(diào)控病毒基因組的復制。前期研究表明，重組黃病毒RdRp蛋白可以通過依賴引物和直接合成2種方式行使病毒RNA的合成功能，同時發(fā)現(xiàn)，僅僅只有3′端并不具有模板活性，還需要與5′端同時存在才能合成RNA[18]。近年來，隨著對蟲媒病毒的研究深入，人們發(fā)現(xiàn)NS5重要功能基團RdRp蛋白除了參與病毒在宿主體內(nèi)的復制，還能夠與宿主Ⅰ型干擾素信號轉(zhuǎn)導通路中的信號分子發(fā)生相互作用，進而抑制宿主的天然免疫反應，為病毒自身的復制創(chuàng)造有利條件。Best等[19]在研究蜱傳腦炎病毒時發(fā)現(xiàn)，當病毒在樹突狀細胞中復制時，非結(jié)構(gòu)蛋白NS5能夠與Ⅰ型干擾素受體相互作用，進而抑制了Janus激酶的磷酸化，最終阻斷Ⅰ型干擾素信號轉(zhuǎn)導通路，隨著研究的繼續(xù)深入，發(fā)現(xiàn)能夠阻斷I型干擾素信號通路的結(jié)構(gòu)域就存在于RdRp中，為2段不連續(xù)的氨基酸序列。由于RdRp蛋白擁有調(diào)控病毒復制的特殊功能，通過抑制RdRp活性，可以抑制病毒在宿主體內(nèi)的復制，因此RdRp成為黃病毒屬病毒抑制劑研究的天然靶點?，F(xiàn)在研究較多的抑制RdRp活性的核苷(酸)類抑制劑，可以作為競爭性的原料類似物終止新生病毒RNA子鏈的延伸，從而抑制病毒在體內(nèi)的復制，在前期研究中已被證明具有較好療效。埃默里大學的Kolykhalov課題組研究發(fā)現(xiàn)，UTP核苷酸的競爭抑制劑能夠有效抑制寨卡病毒RdRp活性，從而阻斷病毒復制[20]。此外，一種丙型肝炎病毒NS5B聚合酶的核苷酸抑制劑-索非布韋，已經(jīng)通過FDA批準美國上市，該抑制劑能夠有效抑制寨卡病毒在人類細胞中的復制[21]。綜上，深入研究黃病毒屬病毒NS5-RdRp蛋白不僅對于深入研究鴨坦布蘇病毒的致病機制、明晰該疫病全面的防控措施具有重要的意義，而且對其他黃病毒屬病毒病的綜合防控具有重要的參考價值。