岳永起，華永琳，賈逸格，李 鍵，熊 燕，熊顯榮

(1.西南民族大學(xué)，青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；3.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

牦牛生活在高寒低氧地區(qū)、具有重要文化和生產(chǎn)意義，被稱(chēng)為高原上的生命之舟。牦牛肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，是符合現(xiàn)代市場(chǎng)需求的綠色食品[1-2]。脂肪組織的生長(zhǎng)發(fā)育是影響牦牛肉品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一。脂肪組織的沉積能力與脂肪細(xì)胞分化的過(guò)程密切相關(guān)，該過(guò)程是一個(gè)系統(tǒng)且復(fù)雜的過(guò)程，受多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子相互協(xié)同作用[3]。

增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(CCAAT/Enhancer binding protein alpha，CEBPα)是堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族的一個(gè)亞家族(增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族：CCAAT Enhancer binding protein，C/EBPs)中最早被發(fā)現(xiàn)的成員[4]。早期研究顯示，CEBPα基因在骨髓組織細(xì)胞分化和機(jī)體免疫等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5-7]。隨后有研究報(bào)道了CEBPα在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的作用[8-9]，CEBPα受CEBPβ、KLFs家族等轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子調(diào)控，同時(shí)它還可以調(diào)控PPARγ、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(Sterol-regulatory element binding proteins, SREBPs)等來(lái)調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化[3, 10]。牟彥雙等[11]通過(guò)添加油酸來(lái)探究雞前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中CEBPα基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)較晚。張萌萌等[12]研究發(fā)現(xiàn)，CEBPα基因在牛肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞分化早期開(kāi)始表達(dá)，分化后期表達(dá)量明顯增加，說(shuō)明CEBPα基因在不同物種脂肪細(xì)胞的表達(dá)模式存在差異。上述研究結(jié)果表明，CEBPα基因?qū)τ谡{(diào)控畜禽脂肪沉積有重要作用，但目前尚未有研究報(bào)道CEBPα基因在牦牛脂肪組織中的作用。

因此，本試驗(yàn)以牦牛為研究對(duì)象，克隆了牦牛CEBPα基因的整個(gè)CDS區(qū)并預(yù)測(cè)了蛋白結(jié)構(gòu)和功能。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了CEBPα基因在牦牛各組織中的表達(dá)及牦牛脂肪細(xì)胞中的表達(dá)模式，為深入研究CEBPα基因在牦牛脂肪組織中的功能研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

試驗(yàn)所用動(dòng)物為4歲左右的金川公牦牛和麥洼公牦牛各4頭，均由四川阿壩羌族藏族自治州金川縣慶林鄉(xiāng)牦牛養(yǎng)殖場(chǎng)提供。采集牦牛的心、肝、脾、腎、胃、小腸、皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪和肌肉組織。采集的組織樣品用高溫滅菌的PBS清洗后，放入2 mL凍存管置于液氮罐帶回實(shí)驗(yàn)室。采集的皮下脂肪組織用PBS清洗后，放入含有5×雙抗(PS)的DMEM培養(yǎng)基中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室分離牦牛原代皮下脂肪細(xì)胞。

1.2 主要試劑

TRIzol購(gòu)自成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司，PrimeScriptRTMaster Mix購(gòu)自TaKaRa，SYBR Real-time PCR mixture試劑購(gòu)自BioTeke，Gel Extraction Kit(100)膠回收試劑盒購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑耗材均購(gòu)自成都鵬世達(dá)有限公司。氯仿、無(wú)水乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自成都鵬世達(dá)有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

采用經(jīng)典的膠原酶消化法分離牦牛原代皮下脂肪細(xì)胞。即將脂肪組織剪碎，加入適量1 mg/mL Ⅰ型膠原酶，37 ℃水浴鍋消化1 h，之后加入細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%的FBS和1% PS的DMEM培養(yǎng)基)終止消化，1 700 r/min離心5 min，后將沉淀重懸，接種在10 cm培養(yǎng)皿中，放入37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天用PBS清洗2～3次，每2 d更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合至80%時(shí)誘導(dǎo)分化，收集0，3，6，9 d的細(xì)胞樣品用于提取RNA。

1.4 RNA提取及cDNA合成

使用TRIzol法提取組織和細(xì)胞樣品總RNA，RNA的質(zhì)量和濃度通過(guò)核酸濃度測(cè)定儀進(jìn)行評(píng)估，OD260/280在1.8～2.0被用于合成cDNA。按PrimeScriptRTMaster Mix試劑盒的說(shuō)明書(shū)合成cDNA。

1.5 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI公布的牦牛預(yù)測(cè)序列(XM_005893918.2)設(shè)計(jì)基因序列，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。引物信息見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.6 PCR擴(kuò)增及克隆

以牦牛皮下脂肪的cDNA為模板，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下：上游引物(10 μmol/L)0.5 μL，下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，cDNA模板(1 000 ng/μL)1 μL，ddH2O 5.5 μL，PCR Mix 7.5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，61 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。電泳完成后，將凝膠在紫外下照膠，將目的片段進(jìn)行切割置于1.5 mL離心管中。參照膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行膠回收。回收產(chǎn)物與pGM-T載體進(jìn)行過(guò)夜連接，其中使用抗生素為氨芐(濃度100 mg/mL)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，挑選3個(gè)陽(yáng)性菌落做菌液PCR。將陽(yáng)性菌液送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

將反轉(zhuǎn)錄后的各組織和細(xì)胞樣品cDNA為模板，以PPIA為內(nèi)參基因，檢測(cè)CEBPα的表達(dá)量。qRT-PCR反應(yīng)體系15 μL：模板cDNA (100 ng/μL)3 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 7.5 μL，ddH2O 3.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.8 Bodipy染色

收集誘導(dǎo)分化9 d的細(xì)胞樣品，用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min;PBS洗3次，用終濃度2 μmol/L的Bodipy染色液染色30 min;PBS洗3次，加入DAPI染色10 min，熒光顯微鏡下拍照。

1.9 生物信息學(xué)分析

根據(jù)獲得的牦牛CEBPα的CDS序列分別做以下幾個(gè)方面的生物信息學(xué)分析：①通過(guò)NCBI在線網(wǎng)站的 ORF Finder ( https：/ /www．ncbi．nlm．nih．gov /orffinder/) 尋找開(kāi)放閱讀框，獲得氨基酸序列。②用DNAMAN軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，然后利用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。③ProtParam 軟件分析牦牛CEBPα蛋白的理化性質(zhì)。④用ProtScale 軟件在線分析牦牛CEBPα蛋白的親疏水性。⑤用Tmpred、NetPhos 2.0 Server在線軟件分析CEBPΑ蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)和磷酸化位點(diǎn)。⑥用HNN和Phyre2在線軟件分析CEBPα蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.10 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行顯著性分析，其中每組數(shù)據(jù)3個(gè)重復(fù)(n=3)，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛CEBPα基因克隆及同源性分析

以牦牛皮下脂肪組織的cDNA為模板，利用PCR擴(kuò)增獲得牦牛CEBPα基因全長(zhǎng)為657 bp，與預(yù)測(cè)序列一致(圖1)。NCBI ORF Finder在線網(wǎng)站進(jìn)行開(kāi)放閱讀框分析，發(fā)現(xiàn)開(kāi)放閱讀框大小為645 bp，編碼214個(gè)氨基酸。

圖1 牦牛CEBPα基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification products of CEBPα gene in yak

牦牛與大西洋鮭、普通牛、大鼠、雞、綿羊、小鼠、獼猴、人的CEBPα基因核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)(表2)。可知牦牛與普通牛的核苷酸同源性最高，為99.73%，與大西洋鮭的核苷酸同源性最低，為73.86%；牦牛與小鼠和大鼠的氨基酸同源性相對(duì)較高，為100%，與普通牛的氨基酸同源性為99.19%，與大西洋鮭的氨基酸同源性低，為75.58%。以核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，聚類(lèi)結(jié)果表明(圖2)，牦牛與普通牛和綿羊親緣關(guān)系較近，與大西洋鮭的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

表2 牦牛CEBPα基因與其他已知物種的核苷酸、氨基酸序列對(duì)比結(jié)果Tab.2 Comparison results of nucleotide and amino acid sequences of CEBPα gene of yaks and other known species

圖2 牦牛與其他物種的CEBPα基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Genetic phylogenetic tree of CEBPα in yaks and other species

2.2 牦牛CEBPα蛋白結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè)

牦牛CEBPα蛋白分子質(zhì)量為23.267 73 ku，分子式為C1004H1574N302O325S6，氨基酸數(shù)為213，含19種氨基酸，其中Ala和Pro含量較高，所占比例分別為11.2%,9.8%，Cys含量較低，所占比例為0.9%(表3)。CEBPα蛋白理論等電點(diǎn)(pI)為5.59，帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)為27，帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)(Asp+Glu)為32。其在哺乳動(dòng)物的尚未成熟的紅細(xì)胞中半衰期為30 h，不穩(wěn)性定指數(shù)(Ⅱ)為57.23，屬于不穩(wěn)定蛋白，脂溶指數(shù)為57.57，親水性的平均值(GRAVY)為-0.844，為親水蛋白。

表3 牦牛CEBPα基因氨基酸組成Tab.3 Amino acid composition of CEBPα gene in yak

CEBPα蛋白 19個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包括Ser(3、17、21、27、40、61、65、125、130、147、180、197)，Thr(158、166、185)，Tyr(7、67、106、208)，其中紅色、綠色、藍(lán)色分別代表絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)(圖3)。

圖3 牦牛CEBPα蛋白磷酸化位點(diǎn)分析Fig.3 The phosphorylation site analysis of yak CEBPα protein

CEBPα蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α螺旋(藍(lán)色)和無(wú)規(guī)則卷曲(紫色)，分別占27.10%，67.29%，β轉(zhuǎn)角和延伸鏈(紅色)占比為0和5.61%(圖4)。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)一致(圖5)。

圖4 牦牛CEBPα蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Secondary structure prediction of CEBPα protein in yaks

圖5 牦牛CEBPα蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of tertiary structure of CEBPα protein in yaks

2.3 牦牛CEBPα基因組織表達(dá)譜

以心為參照，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)牦牛組織中CEBPαmRNA的表達(dá)，結(jié)果表明，CEBPα在牦牛各組織中廣泛表達(dá)(圖6)，在皮下脂肪組織的表達(dá)顯著高于其他組織(P<0.05)，在腎、脾和內(nèi)臟脂肪組織中表達(dá)量相對(duì)較低。

2.4 CEBPα在牦牛皮下脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中的表達(dá)

從牦牛皮下脂肪組織中分離得到的原代脂肪細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。分離得到的牦牛前體脂肪細(xì)胞類(lèi)似于成纖維細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈梭形或三角形(圖7-A)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到100%融合時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)分化(圖7-B)。誘導(dǎo)分化9 d，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，由梭形變?yōu)椴灰?guī)則形態(tài)或圓形，細(xì)胞內(nèi)充滿大量脂滴(圖7-C)。Bodipy染色結(jié)果表明(圖8)，分化9 d，有明顯的脂滴積累。

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。The different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05) .

A.牦牛前體脂肪細(xì)胞(Preadipocyte，Pre)的形態(tài)；B.誘導(dǎo)分化第0天的細(xì)胞形態(tài)圖；C.誘導(dǎo)分化第9天的細(xì)胞形態(tài)圖。A.The morphology of yak preadipocytes (Preadipocyte, Pre)；B.The morphology of cells at day 0 of induced differentiation；C.The morphology of cells on the 9th day of induced differentiation.

圖8 Bodipy染色(100×)Fig.8 Bodipy stain (100×)

在誘導(dǎo)分化第0，3，6，9天收集牦牛脂肪細(xì)胞樣品，采用qPCR技術(shù)對(duì)CEBPαmRNA的表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量分析(圖9)。研究結(jié)果表明，CEBPα在分化的第3，6，9天與第 0 天相比，均極顯著上升(P<0.01)，在分化過(guò)程中呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。

3 討論與結(jié)論

研究表明，在構(gòu)建體外培養(yǎng)的牛成肌細(xì)胞體系中，CEBPα能誘導(dǎo)成肌細(xì)胞向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化[13]。在牛肌肉的干細(xì)胞(MSCs)中過(guò)表達(dá)CEBPα能誘導(dǎo)LPL、PPARγ、C/EBPβ和C/EBPδ基因的表達(dá)，表明CEBPα基因在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程可能具有重要作用[14]。此外Wang等[15]研究指出，牛CEBPα基因可以調(diào)控ABHD5基因(alpha/beta hydrolase 5，ABHD5)，間接調(diào)控細(xì)胞脂質(zhì)代謝。因此，本研究采用金川牦牛和麥洼牦牛為研究對(duì)象，獲得牦牛CEBPα的基因序列及其在牦牛脂肪組織中的表達(dá)特性，為后續(xù)研究CEBPα基因?qū)﹃笈Ｖ境练e的具體作用機(jī)制提供了依據(jù)和參考。

不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。The different capital letters indicate extremely significant difference(P<0.01) .

通過(guò)PCR成功獲得牦牛CEBPα基因，其CDS區(qū)全長(zhǎng)645 bp，編碼214個(gè)氨基酸，該蛋白為不穩(wěn)定親水性蛋白。同源性分析結(jié)果表明，牦牛CEBPα基因與普通牛的同源性相對(duì)較高，核酸同源性為99.73%，氨基酸同源性為99.19%，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果顯示，牦牛與普通牛和綿羊的相似性較高。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與同源性比對(duì)結(jié)果一致，說(shuō)明CEBPα基因的編碼區(qū)在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守。

組織表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CEBPα在牦牛不同組織中均有表達(dá)，其中皮下脂肪表達(dá)水平最高，內(nèi)臟脂肪表達(dá)量最低。說(shuō)明CEBPα可能在調(diào)控牦牛皮下脂肪的發(fā)育中具有重要作用。有研究報(bào)道，CEBPα在小鼠脂肪組織、肺、胎盤(pán)和肝臟中高表達(dá)[15-16]。池永東等[17]研究發(fā)現(xiàn)，CEBPα在皮下脂肪組織中表達(dá)量最高，這與本研究的結(jié)果相一致，推測(cè)該基因可能在反芻動(dòng)物中相對(duì)保守，在其他物種中存在物種特異性。

分離到的牦牛皮下脂肪細(xì)胞呈梭形或三角形，在經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)成脂，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)則形態(tài)或圓形，并伴隨著脂滴的產(chǎn)生和積聚。劉敏等[18]分離得到豬皮下前體脂肪細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則梭形。這與本試驗(yàn)分離的得到的前體脂肪細(xì)胞形態(tài)相一致。表明成功分離了牦牛前提脂肪細(xì)胞。CEBPα在牦牛脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中隨著分化的進(jìn)行，其表達(dá)量逐漸上升。筆者推測(cè)CEBPα可能在牦牛脂肪細(xì)胞分化早期發(fā)揮作用。有研究報(bào)道，在3T3-L1脂肪細(xì)胞中，CEBPα的表達(dá)量隨著分化的進(jìn)行，表達(dá)量逐漸升高，在第6天達(dá)到頂峰[19]。這與筆者的研究結(jié)果相一致。王家麒等[20]研究表明,在綿羊前體脂肪細(xì)胞中。隨著誘導(dǎo)分化的進(jìn)行CEBPα表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降。這與筆者的研究結(jié)果存在差異，推測(cè)其可能的原因，是由于物種之間的差異造成的。

本研究克隆了牦牛的CEBPα基因，其CDS區(qū)全長(zhǎng)645 bp，編碼214個(gè)氨基酸，該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為57.23，表明該蛋白具有不穩(wěn)定性，親水性占比大于疏水性，為親水性蛋白。CEBPα在皮下脂肪組織中高表達(dá)，在內(nèi)臟脂肪組織中低表達(dá)。在牦牛前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過(guò)程中，其表達(dá)量逐漸升高。以上結(jié)果為牦牛CEBPα基因在牦牛脂肪組織中的功能研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。