王慶彪，王艷萍，令狐波，錢慧慧，趙秋菊，張 麗

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院，北京 100097;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蔬菜種質(zhì)改良北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097)

鹽脅迫是影響作物產(chǎn)量的主要環(huán)境問(wèn)題之一，目前全世界范圍內(nèi)19.6%的耕地及超過(guò)2%的非耕地已經(jīng)出現(xiàn)鹽堿化。在灌溉及半干旱地區(qū)，由于不合理施肥造成的鹽堿化土地面積正在逐年增加，預(yù)計(jì)到2050年將增加1倍[1]。中國(guó)是鹽堿地大國(guó)，在6 700萬(wàn)hm2耕地中，有10%的耕地為鹽堿化土壤[2]。土壤鹽堿化引起植物葉片黃化、脫水和植株死亡，也影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。

蘿卜(RaphanussativusL.)是我國(guó)重要的蔬菜作物，年播種面積107萬(wàn) hm2，占總體蔬菜播種面積的5%。蘿卜還是重要的出口創(chuàng)匯蔬菜，隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的深入，出口加工蘿卜已成為許多地方種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的主要經(jīng)濟(jì)作物之一。關(guān)于蘿卜耐鹽性的報(bào)道較少，Grattan等[3]將蘿卜定義為中等鹽敏感植物，而Sonneveld等[4]認(rèn)為蘿卜是鹽敏感類蔬菜作物。研究表明，鹽脅迫影響蘿卜種子萌發(fā)、幼苗鮮質(zhì)量、葉面積及水分和養(yǎng)分利用率，最終影響產(chǎn)量和品質(zhì)[5-7]。培育耐鹽品種是解決這一問(wèn)題的根本途徑之一。

植物耐鹽機(jī)理是一種復(fù)雜的生理生化過(guò)程，是由多個(gè)基因參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[8]。Sun等[9]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析研究了蘿卜鹽脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制，在mRNA水平上鑒定出8 709個(gè)差異表達(dá)基因。這些基因可能參與鹽脅迫信號(hào)感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)、滲透調(diào)節(jié)、離子平衡和活性氧清除等響應(yīng)過(guò)程。鹽脅迫減少植物組織中的氣體交換，使得CO2向葉片供應(yīng)受阻，影響光合電子傳遞鏈，從而產(chǎn)生對(duì)植物體有害的活性氧(ROS)[10]。過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是清除活性氧的重要物質(zhì)。CAT和SOD基因響應(yīng)鹽脅迫在許多植物中得到驗(yàn)證，例如在棉花(GossypiumL.)中過(guò)表達(dá)GhCAT1和GhSOD1可提高耐鹽性[11]。本研究針對(duì)鹽脅迫對(duì)蘿卜發(fā)芽率、幼苗植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響，以及RsCAT和RsSOD基因在不同濃度鹽脅迫下耐、感鹽品種中的表達(dá)模式，以期為了解蘿卜響應(yīng)鹽脅迫的分子機(jī)制，培育耐鹽品種提供參考。

1 材料和方法

1.1 種子鹽處理方法

試驗(yàn)材料包括11個(gè)不同類型蘿卜品種，其中Tamgocho Hama Daikon和Yura Hama Daikon屬于東亞野蘿卜，沒(méi)有膨大的肉質(zhì)根(表1)。每個(gè)處理取100粒種子，置于鋪有3層濾紙的培養(yǎng)皿中，濾紙分別用100，200 mmol/L的NaCl溶液充分浸濕，25 ℃下暗培養(yǎng)，以清水為對(duì)照，3次重復(fù)。3 d后調(diào)查種子發(fā)芽數(shù)，計(jì)算發(fā)芽率(Germination percent，GP)和發(fā)芽指數(shù)(Germination index，GI)。GP=(發(fā)芽數(shù)/種子總數(shù))×100%；GI=鹽處理發(fā)芽率/對(duì)照發(fā)芽率。分別選出發(fā)芽率最高和最低的品種(Yura Hama Daikon和五斤紅)為耐鹽和感鹽品種進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

表1 供試材料來(lái)源及主要性狀Tab.1 Materials and main traits

1.2 幼苗鹽處理方法

試驗(yàn)在溫室中進(jìn)行，種子用3%次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒15 min，播種于裝有珍珠巖的育苗盤中。兩葉一心期移栽到泡沫漂浮板中，用海綿球固定，置于1/2霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液(pH值7.0)中，白天和夜間平均溫度分別為28，20 ℃，14 h光照。緩苗3 d后進(jìn)行鹽脅迫處理。設(shè)置2個(gè)NaCl濃度梯度：100，200 mmol/L，以不加鹽的營(yíng)養(yǎng)液為對(duì)照。為保證鹽濃度不變，每2 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液。每個(gè)處理50株，3次重復(fù)。

1.3 鹽脅迫對(duì)蘿卜幼苗生長(zhǎng)的影響

圖1 蘿卜幼苗鹽處理后葉片焦化程度的分級(jí)Fig.1 Grading of leaf scorch after salt treatment

1.4 RNA提取和qPCR分析

分別取未處理(0 h)、鹽脅迫后24 h，48 h，7 d，14 d表現(xiàn)脅迫損傷的葉片，每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍后放入-80 ℃冰箱保存。利用植物RNA提取試劑盒(華越洋公司)提取總RNA，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA濃度、純度及完整性。

根據(jù)蘿卜“Aokubi DH”參考基因組注釋結(jié)果[12]，注釋基因RSG17403和RSG21616分別編碼過(guò)氧化氫酶基因(RsCAT)和超氧化物歧化酶(RsSOD)基因，選擇RsRPⅡ?yàn)閮?nèi)參基因，根據(jù)基因CDS序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行qPCR分析，所用引物信息見(jiàn)表2。

表2 qRT-PCR所用引物信息Tab.2 Primers information for qRT-PCR

取1 μg總RNA，DNase Ⅰ消化后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL，包含100 ng cDNA，10 μL 2×TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus，TaKaRa)，各0.4 μmol/L上下游引物。反應(yīng)程序如下：95 ℃，30 s；40 循環(huán)(95 ℃，5 s；60 ℃，20 s)；95 ℃，5 s；60 ℃，1 min；50 ℃，30 s。擴(kuò)增數(shù)據(jù)使用LIGHTCYCLER 480(version 1.5，Roche)軟件分析，相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)不同蘿卜品種發(fā)芽率的影響

種子萌發(fā)階段是蘿卜對(duì)鹽脅迫最敏感的時(shí)期之一，鹽脅迫可降低種子發(fā)芽率，且不同品種下降程度不同。不同濃度鹽脅迫(100，200 mmol/L)對(duì)11個(gè)蘿卜品種發(fā)芽率的影響結(jié)果表明(表3)：鹽脅迫下所有品種的發(fā)芽率均受影響，隨著鹽濃度的增大發(fā)芽率下降明顯，且在品種之間存在明顯差異。在200 mmol/L鹽脅迫下，五斤紅和紅櫻桃發(fā)芽率下降最為明顯，分別為3.33%，9.00%；二者的發(fā)芽指數(shù)均小于0.1(0.04，0.09)，屬于鹽敏感品種；Yura Hama Daikon和葉用蘿卜的發(fā)芽率下降幅度最小，分別為94.33%，86.00%，發(fā)芽指數(shù)分別為0.94，0.86，屬于耐鹽品種。

表3 鹽脅迫對(duì)11個(gè)蘿卜品種發(fā)芽率的影響Tab.3 Effect of salt stress on the germination percentage and germination index of radish seeds

2.2 鹽脅迫對(duì)蘿卜幼苗生長(zhǎng)的影響

選取耐鹽品種Yura Hama Daikon和鹽敏感品種五斤紅進(jìn)行幼苗鹽脅迫試驗(yàn)，不同濃度鹽處理21 d后，與對(duì)照相比，無(wú)論是耐鹽品種還是感鹽品種，其株高均明顯降低。隨著鹽處理濃度的增加，這種抑制生長(zhǎng)的作用愈加明顯(表4，圖2-A、B)。耐鹽品種Yura Hama Daikon在100，200 mmol/L鹽濃度處理后，株高分別降低26.05%，46.18%，鹽敏感品種五斤紅株高則分別下降35.64%，75.25%?？梢?jiàn)耐鹽品種株高下降幅度明顯低于鹽敏感品種。

表4 不同鹽濃度處理對(duì)耐、感鹽蘿卜幼苗株高、葉焦指數(shù)的影響Tab.4 Effect of salt stress on the plant height and leaf scorch index in to salt-tolerant and salt-sensitive radish

圖片左側(cè)為對(duì)照;右側(cè)為200 mmol/L鹽水處理植株。Left.Control；Right.200 mmol/L NaCl treatment.

鹽脅迫影響植株生長(zhǎng)，主要是由于毒害植株根系和葉片，造成根系減少，葉片黃化焦枯，影響植株的光合作用。本研究通過(guò)調(diào)查鹽脅迫后的植株葉焦指數(shù)，研究不同濃度鹽處理對(duì)植株葉片發(fā)育的影響。鹽處理21 d后，耐鹽品種(Yura Hama Daikon)和感鹽品種(五斤紅)的葉焦指數(shù)均顯著升高，且隨著鹽處理濃度的增加，葉焦指數(shù)也顯著增加(表4)。在100，200 mmol/L濃度的鹽處理后，Yura Hama Daikon的葉焦指數(shù)分別為7.78和20.56，明顯低于五斤紅的葉焦指數(shù)(20.11和56.11)。結(jié)果表明Yura Hama Daikon的耐鹽性顯著強(qiáng)于五斤紅(圖3)。

圖3 200 mmol/L鹽濃度脅迫對(duì)蘿卜品種Yura Hama Daikon(A)和五斤紅(B)幼苗葉片的影響Fig.3 Effect of salt stress(200 mmol/L)on leaf growth in Yura Hama Daikon (A) and Wujinhong (B)

2.3 耐、感鹽蘿卜品種中RsCAT和RsSOD基因的表達(dá)模式

鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，嚴(yán)重破壞正常新陳代謝，植物可以通過(guò)合成抗氧化酶抵御細(xì)胞氧化的傷害，其中過(guò)氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)能夠清除活性氧，保護(hù)細(xì)胞減輕傷害。本試驗(yàn)研究了這2個(gè)基因在不同鹽濃度過(guò)程中的表達(dá)模式，結(jié)果表明：耐、感品種中RsCAT基因的表達(dá)量在中等鹽濃度(100 mmol/L)及高濃度鹽(200 mmol/L)處理后表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，即隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)(圖4-A)。但不同鹽濃度處理時(shí)基因表達(dá)量最高值出現(xiàn)的時(shí)間不同，100 mmol/L處理時(shí)該基因的表達(dá)量在7 d達(dá)到最高值，耐、感品種間沒(méi)有顯著差異；而200 mmol/L處理時(shí)，耐鹽品種中該基因表達(dá)量持續(xù)升高，7 d后達(dá)到峰值，而鹽敏感品種中該基因的表達(dá)量在48 h最高，之后逐漸降低(圖4-A)。這表明：較高濃度的鹽脅迫能夠促使抗過(guò)氧化氫酶基因RsCAT在耐鹽品種中表達(dá)量逐漸升高，且維持的時(shí)間較長(zhǎng)，通過(guò)持續(xù)合成抗氧化酶，來(lái)減少植株的傷害；而感鹽品種中RsCAT基因迅速表達(dá)但抗氧化持續(xù)能力較弱。

RsSOD基因表達(dá)模式與RsCAT不同，100 mmol/L鹽處理后，該基因的表達(dá)量在14 d時(shí)最高，且在耐鹽品種中的表達(dá)量顯著高于鹽敏感品種。高鹽濃度(200 mmol/L)處理后，耐鹽品種的應(yīng)激響應(yīng)更迅速，24 h表達(dá)量最高，之后維持較高的水平，而鹽敏感品種RsSOD的表達(dá)量在24 h和7 d均顯著低于耐鹽品種，其表達(dá)量最大值出現(xiàn)在14 d后(圖4-B)。

對(duì)比RsCAT與RsSOD基因的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)雖然二者均為抗氧化基因，但在響應(yīng)鹽脅迫時(shí)，RsSOD應(yīng)激響應(yīng)更迅速，而RsCAT基因抗氧化作用維持的時(shí)間更長(zhǎng)，來(lái)減輕植株的傷害。

不同小寫字母表示同一時(shí)間基因表達(dá)量在耐、感鹽品種間差異顯著(P<0.05)。Different small letters indicate significant difference in gene expression between salt-tolerant and salt-susceptible varieties at the same time(P<0.05).

3 討論與結(jié)論

種子萌發(fā)期和幼苗期是蘿卜對(duì)鹽脅迫響應(yīng)最敏感的時(shí)期，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、根長(zhǎng)、苗高可以作為初步篩選植物抗性的依據(jù)，這主要是由于種子萌發(fā)需要大量水分，高濃度的鹽會(huì)降低培養(yǎng)皿中的水勢(shì)，抑制種子吸收水分，進(jìn)而降低發(fā)芽率[13]?；诖耍狙芯恳愿邼舛塞}處理后的發(fā)芽率作為指標(biāo)，篩選出鹽敏感品種和耐鹽品種。這一結(jié)果也在進(jìn)一步的鹽脅迫試驗(yàn)中獲得證實(shí)，因?yàn)楦鶕?jù)幼苗株高及葉焦指數(shù)等植株生長(zhǎng)指標(biāo)，耐鹽品種依然比鹽敏感品種表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽能力；因此，以發(fā)芽率作為初步篩選耐鹽材料的方法是可靠的。

植物在鹽脅迫下會(huì)產(chǎn)生大量使細(xì)胞發(fā)生氧化的活性氧，此時(shí)會(huì)產(chǎn)生一些毒性物質(zhì)，如丙二醛。植物具有清除活性氧的酶系，可抵御活性氧對(duì)細(xì)胞的破壞，包括超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)等[14]。CAT和SOD參與鹽脅迫的響應(yīng)以及與植物耐鹽性的關(guān)系已經(jīng)在多種作物中報(bào)道。Sun等[9]對(duì)蘿卜品種NAU-YH鹽脅迫48 h后的轉(zhuǎn)錄組分析表明，鹽脅迫能夠提高RsSOD的表達(dá)量。鹽脅迫下CAT基因的表達(dá)顯著增加，該基因的表達(dá)水平也與耐鹽性存在相關(guān)性[15]。過(guò)表達(dá)Cu/Zn-SOD或CAT基因的轉(zhuǎn)基因大白菜(BrassicacampestrisL.)[16]、番茄(SolanumlycopersicumL.)[17]、水稻(OryzasativaL.)[18]能夠顯著減少鹽脅迫引起的氧化損傷，顯著提高鹽脅迫的抗性。本研究結(jié)果也表明：在鹽脅迫下，耐鹽品種中RsCAT和RsSOD基因的表達(dá)模式不同于鹽敏感品種，二者在蘿卜響應(yīng)鹽脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。但在同一品種中2個(gè)基因的表達(dá)模式不同，例如耐鹽品種在高濃度鹽脅迫條件下，RsSOD在24 h迅速達(dá)到最高值，而RsCAT在7 d后達(dá)到最高值。這是因?yàn)镾OD和CAT在清除自由氧時(shí)所起的作用不同。鹽脅迫引起活性氧大量積累，在清除過(guò)程中，首先由SOD將O2-轉(zhuǎn)變成H2O2，再由CAT將H2O2轉(zhuǎn)變成H2O和O2[19]。RsSOD基因先于RsCAT基因發(fā)揮作用，所以在響應(yīng)鹽脅迫時(shí)，RsSOD應(yīng)激響應(yīng)更迅速，而RsCAT基因抗氧化作用維持的時(shí)間更長(zhǎng)，來(lái)減輕植株的傷害。

本研究通過(guò)鹽脅迫發(fā)芽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)材料表現(xiàn)為中等鹽敏感耐鹽品種，所用的大紅袍和櫻桃蘿卜2個(gè)栽培類型表現(xiàn)為鹽敏感，這是否意味著這2個(gè)蘿卜栽培類型普遍具有較弱的耐鹽能力，還需要更多的材料數(shù)據(jù)支持。Nishio等[20]認(rèn)為Yura Hama Daikon是生長(zhǎng)在日本海濱的野生蘿卜，很少出現(xiàn)在陸地或河邊，具有良好的鹽脅迫適應(yīng)性。本研究結(jié)果也證實(shí)了該品種具有很好的耐鹽性，其耐鹽性明顯高于栽培蘿卜，這為進(jìn)一步研究蘿卜響應(yīng)鹽脅迫的分子機(jī)制和選育耐鹽品種提供了良好的材料。在后續(xù)的研究中，將利用耐、感鹽構(gòu)建遺傳群體，篩選耐鹽性狀關(guān)鍵基因，為創(chuàng)制耐鹽新種質(zhì)提供支撐。