許成梅，陳 丹，徐冬月，趙慶宇婧，林玉萍，趙聲蘭

（1.云南中醫(yī)藥大學中藥學院，昆明 650500；2.云南省煙草質量監(jiān)督檢測站，昆明 650106；3.昆明海關技術中心，昆明 650200）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s Disease，AD）俗稱老年癡呆（dementia），是一種發(fā)生于中老年的以進行性認知障礙和記憶能力下降為主的退行性神經(jīng)病變，是繼心腦血管疾病和惡性腫瘤之后，老年人致殘、致死的第三大疾病。中國60歲以上的人口中，70%～80%伴有不同程度的健忘和癡呆，是世界上患者人數(shù)最多的國家［1］，嚴重危害和影響國人健康。AD的發(fā)病機制至今尚不明確，中醫(yī)理論認為“以腎虛髓虧為本，痰瘀阻滯為標，五臟失調，腦髓失用”為老年癡呆之病機［2］。傳統(tǒng)健腦藥食同源核桃（Jug?lansregiaL.）仁營養(yǎng)豐富，古典記載“胡桃仁頗類其狀”［3］，藥典收載的功能為“補腎，溫肺，潤腸，用于腎陽不足、腰膝酸軟、陽痿遺精、虛寒喘嗽、腸燥便秘”［4］，可用于防治老年癡呆［5-7］。核桃成分復雜多樣，本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法分析核桃防治AD的作用成分及其靶點和機制，為核桃仁用于老年病癡呆防治提供更多的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 核桃活性成分及潛在靶點的篩選

通過TCMSP（Traditional Chinese Medicine Sys?tems Pharmacology）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫［8］和相關文獻獲得核桃的化學成分及相應潛在靶點?？诜锢枚龋∣B）反映藥物口服進入體循環(huán)的比例［9］，類藥性（DL）是根據(jù)混合物的結構和性質表征成藥特性，用于藥物發(fā)現(xiàn)早期的初篩［10］。通常以OB≥15%和DL≥0.18作為篩選標準。此外，血腦屏障（BBB）是大腦與身體其他部位之間的高度選擇性物理屏障，但它也阻止了許多治療藥物進入大腦參與反應，從而使疾病的治療很困難。因此，它也是藥物選擇的重要參數(shù)。但隨著年齡的增長以及神經(jīng)血管和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，血腦屏障的通透性會有所增加［11］。

1.2 AD靶點搜集

使 用GeneCards（https：//www.genecards.org/）、TTD（Therapeutic Target Database）（https：//db.idrblab.org/ttd/）和OMIM（https：//omim.org/）3個數(shù)據(jù)庫［12］，以“Alzheimer′s Disease”和“dementia”為關鍵詞搜索老年癡呆相關靶點，將3個數(shù)據(jù)庫的靶點進行歸并得到老年癡呆的靶點，以評分≥5為篩選條件，獲得AD相關靶點。

1.3 潛在靶點分析

將核桃的潛在靶點與AD相關的靶點通過R3.6.2軟件取交集，即為核桃作用于AD的潛在靶標。

1.4 網(wǎng)絡構建

將交集靶點信息整理成Excel軟件中的格式導入網(wǎng)絡可視化軟件Cytoscape3.7.2（http：//cytoscape.org/，v3.7.2）構建核桃“活性成分-藥物-疾病-靶點”網(wǎng)絡圖，并運用Meta-analysis和Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡拓撲參數(shù)：選取節(jié)點度（Degree）前三位的活性成分為主要活性成分［13］，進一步了解核桃活性成分與AD相關靶點的相互作用關系。目前，STRING（Search Tool for Recurring Instances of Neigh?bouring Genes）是蛋白質相互作用覆蓋種類最多的數(shù)據(jù)庫［14］，將交集靶點導入STRING（https：//stringdb.org/）在線分析平臺以獲得蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡（Protein Protein Interaction Network，PPI）。蛋白質-蛋白質相互作用評分的置信度設置為0.900，并隱藏無相互作用的蛋白。將獲得的PPI數(shù)據(jù)導出為TSV文件格式并導入到Cystoscape 3.7.2軟件繪制網(wǎng)絡圖，利用Metascape和CytoNCA插件對其進行拓撲學分析，包括度中心性（DC）、特征向量（EC）、中介中心性（BC）、接近中心性（CC），各值越大代表該點在網(wǎng)絡圖中越重要，取DC、EC、BC、CC值大于其2倍中位數(shù)進行關鍵靶點篩選［15］。

1.5 GO功能富集和KEGG信號通路分析

使用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫進行GO功能富集和KEGG信號通路分析。主要進行細胞、分子和生物三方面功能富集分析，以統(tǒng)計學超幾何分布定量（P）評估相關性，設置P<0.01。

2 結果與分析

2.1 核桃活性成分篩選結果

以OB%≥15%，DL≥0.18為篩選標準，從TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得核桃活性成分14種。相關文獻報道核桃中許多其他成分可改善記憶衰退，預防AD，如芥子酸（Sinapic acid）、咖啡酸（Caffeic acid）、兒茶素（Catechin）、褪黑素（Melatonin）、丁香酸（Syringic acid）、槲皮素（Quercetin）、α-亞麻酸（alpha-Linolenic acid）、香豆酸（Coumaric acid）、亞油酸（Linoleic acid）、阿魏酸（Ferulic acid）、油酸（Oleic acid）、沒食子酸（Gallic acid）、維生素E（Vitamin E）、綠原酸（Chlorogenic acid）和蘆?。≧utin）（OB：64.15%、54.97%、54.83%、52.96%、47.78%、46.43%、45.01%、43.29%、41.90%、39.56%、33.13%、31.69%、14.26%、13.61%、3.20%；DL：0.08、0.05、0.24、0.11、0.06、0.28、0.15、0.04、0.14、0.06、0.14、0.04、0.55、0.31、0.68）［16-26］。綜合數(shù)據(jù)庫搜索和文獻報道，最終獲得核桃活性成分29種（表1）。

表1 核桃潛在活性成分

2.2 核桃作用于AD的潛在靶點

基于所獲得的29種化合物進行搜索，得到鞣花酸、2，2′，3，3′，4，4′-四甲氧基-6，6′-聯(lián)苯二甲酸二甲酯、α-亞麻酸、咖啡酸、兒茶素、綠原酸、香豆酸、阿魏酸、沒食子酸、亞油酸、褪黑素、油酸、槲皮素、蘆丁、芥子酸、丁香酸和維生素E共17種化合物具有潛在靶點365個。從GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫獲得2 645個與AD相關的靶點基因（評分≥5）。通過R3.6.2軟件將AD相關靶點基因和核桃的成分潛在靶點相交，結果顯示核桃成分的159個潛在靶標與AD相關（表2）。

表2 核桃成分中與AD相關的潛在靶點

2.3 網(wǎng)絡構建

通過Cytoscape 3.7.2軟件構建核桃“活性成分-藥物-疾病-靶點”網(wǎng)絡（圖1）。該網(wǎng)絡包含278個節(jié)點，核桃活性成分17個，作用靶點159個，423條相互作用的邊。作用靶點最多的成分為槲皮素、油酸、鞣花酸、蘆丁和阿魏酸；受最多化合物作用的靶點為前列腺素過氧化物合成酶（PTGS1/2）、視黃酸受體（RXRA）、轉錄因子p65（RELA）、單胺氧化酶（MAOB）和一氧化氮合酶（NOS3）等。表明核桃通過多成分、多靶點共同作用來防治AD。

圖1 核桃活性成分-靶點網(wǎng)絡

續(xù)表2

將159個靶基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫進行分析，獲得靶點蛋白相互作用關系網(wǎng)絡（圖2）。關鍵蛋白為RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、絲裂原激活蛋白激酶1（MAPK1）、轉錄因子AP-1（JUN）、轉錄因子p65（RELA）、白介素-6（IL6）等（圖2）。這些蛋白可能在核桃防治AD中起關鍵作用。

圖2 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡圖（上）和關鍵蛋白排序（下）

2.4 GO功能富集分析

采用DAVID數(shù)據(jù)庫，對核桃的159個AD相關靶點進行細胞、分子和生物3個方面功能進行富集分析（P<0.01）（圖3）。其中，細胞成分主要涉及細胞外間隙（P=2.19E-24）、胞外區(qū)（P=3.01E-12）、細胞溶質（P=9.45E-09）、質膜（P=7.85E-07）和小窩（P=1.47E-06）等；分子功能主要涉及酶結合（P=5.03E-19）、相同的蛋白質結合（P=2.20E-16）、蛋白質同二聚化活性（P=3.22E-14）、蛋白質異二聚化活性（P=1.00E-11）和蛋白質結合（P=4.88E-11）等；生物過程主要包括對藥物的反應（P=1.91E-23）、老化（P=4.10E-18）、對缺氧的反應（P=1.62E-16）、細胞增殖的正調控（P=4.15E-16）和凋亡過程的負調控（P=4.15E-16）等，表明相關靶點通過調控不同生物學功能作用于AD。

圖3 GO功能富集結果

2.5 KEGG通路分析

對核桃的159個AD相關靶點進行KEGG通路富集分析（P<0.01），篩選得到160條相關通路，前30條重要通路見圖4。其中，尿病并發(fā)癥中的AGERAGE信號通路（P=7.88E-25）、流體剪切應力與動脈粥樣硬化（P=6.40E-22）、PI3K-Akt信號通路（P=5.93E-16）、白細胞介素-17信號通路（P=3.77E-15）、HIF-1信號通路（P=4.91E-15）、TNF信號通路（P=8.51E-15）可能為核桃不同成分作用于AD的關鍵通路。

圖4 KEGG通路分析結果

3 討論

網(wǎng)絡藥理學以系統(tǒng)生物學為基礎，系統(tǒng)闡述藥物成分與機體相互作用的原理與規(guī)律，可用來預測中藥單體［27］或復方［28］的各有效成分及其作用靶點和參與的相關通路，探索藥物與疾病間的關聯(lián)性，解釋中藥治療疾病的作用機制。本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法篩選得到核桃17種活性成分具有AD相關的潛在靶點159個，主要為酚類、脂肪酸、黃酮類化合物。槲皮素、油酸、鞣花酸、蘆丁和阿魏酸等顯示出較強的靶向作用，均可改善認知，延緩記憶衰退。槲皮素可減輕大鼠記憶障礙，其機制可能與調節(jié)海馬和前額葉皮質中Copine 6和TREM1/2的BDNF相關表達失衡有關［26］。鞣花酸具有神經(jīng)保護作用，它可以改善AD相關的認知障礙，可能是由RAC-ine絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶/糖原合酶激酶3β（AKT1/GSK3β）信號介導的［22］。本研究獲得的PTGS1/2、RXRA、RELA、MAOB和NOS3可能是AD的關鍵靶點。RXR是膽固醇合成和代謝的關鍵調節(jié)劑，RXRA是核配體激活的轉錄因子家族的成員，AD患者的膽固醇代謝會發(fā)生改變，RXRA基因變異可能通過影響腦膽固醇代謝而成為AD的危險因素［29］。在AD的淀粉樣斑塊周圍可觀察到反應性星形膠質細胞，反應性星形膠質細胞通過MAOB異常而產(chǎn)生抑制性膠質遞質GABA，在AD模型小鼠的齒狀回釋放的GABA通過作用于突觸前GABA受體而降低顆粒細胞的刺激率；在AD患者死后，腦中GABA和MAOB顯著上調，選擇性抑制GABA的合成或釋放可能是治療AD記憶障礙的有效策略［30］。認知障礙大鼠白細胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子ɑ（TNF-ɑ），誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的表達顯著增加，且炎癥因子水平與Aβ42沉積呈正相關［31］，所涉及的靶點均為本研究中發(fā)現(xiàn)的AD相關重要靶點。

KEGG通路分析獲得的一條重要通路為尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路，AD與糖尿病關系密切，具有相似的病理改變，被稱為“第3種糖尿病”［32］。研究表明，糖尿病腦病的特點是認知障礙、神經(jīng)化學和結構異常，可通過下調BACE1、抑制AGE/RAGE軸和腦內炎癥進行改善［33］。PI3K/Akt信號通路通過發(fā)揮抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護作用而在調節(jié)AD中起重要作用［34］。β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積是AD的發(fā)病機制之一，AD的發(fā)生與缺氧有一定關系。在分子水平上，缺氧應答主要靠HIF-1進行調節(jié)和介導，HIF-1的高表達可以通過與BACE1啟動子結合，繼而誘導BACE1的表達并導致Aβ水平升高［35］。

盡管目前AD的發(fā)病機制尚不明確，核桃的健腦功能也有待開發(fā)，但借助網(wǎng)絡藥理學研究顯示核桃可從多成分、多靶點、多途徑協(xié)同干預AD的發(fā)生和發(fā)展，其中作用靶點最多的成分為槲皮素、油酸、鞣花酸、蘆丁和阿魏酸，受最多化合物作用的靶點為前列腺素過氧化物合成酶、視黃酸受體、轉錄因子p65、單胺氧化酶和一氧化氮合酶，為核桃防治AD的功能成分和靶點機制提供了數(shù)據(jù)和理論支持。